阿拉瑞林聯(lián)合5-FU對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的抑制作用

李潤連 張三元

子宮內(nèi)膜癌是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，占女性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤的20% ～30%，近些年發(fā)病率不斷上升。子宮內(nèi)膜癌的治療早期以手術(shù)為主，但晚期、復(fù)發(fā)性及年輕要求保留生育能力的患者，以激素及化療等姑息治療為主［1］，現(xiàn)有的化療單藥或聯(lián)合用藥方案不良反應(yīng)大、療效不佳是其主要缺點。阿拉瑞林是人工合成的促性腺激素釋放激素( gonadotrop in-releasing hormone，GnRH)九肽類似物，其藥效是母體的15倍［2］。張玉泉等［3］研究表明，它對子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)癌基因ras、neu、myc的表達具有調(diào)控作用。本研究通過觀察阿拉瑞林對子宮內(nèi)膜癌的促凋亡作用，探討可能的分子機制，為子宮內(nèi)膜癌提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物及細胞株 BALB/Cnu/nu裸鼠，4～6周齡，雌性，體重18～20g購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXK(京)2007-0001，SPF級環(huán)境飼養(yǎng);人子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC-1B購自中國醫(yī)學科學院上海研究所。

1.1.2 藥物與試劑 阿拉瑞林購自安徽豐原制藥有限公司馬鞍山制藥廠;5-FU購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司;bcl-2試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及動物模型的建立。HEC-1B細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期的細胞，在超凈工作臺以TB空針接種于裸鼠右前肢近腋窩處皮下，每只注射0.1ml(約含5×106個細胞)，接種完畢后將24只裸鼠隨機分為4組，每組6只，SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)1周，成瘤率為100%，開始給藥。阿拉瑞林組:背部肌肉注射35μg/kg，藥物濃度按每只裸鼠每次注射1.0ml配制，1次/d，連續(xù)30d;對照組:相同劑量的生理鹽水;5-FU組:腹腔注射5-FU20mg/kg，劑量為1.0ml，1次/d，連續(xù)5d;聯(lián)合組:(阿拉瑞林+5-FU)阿拉瑞林35μg/kg背部肌肉注射30d，5-FU20mg/kg腹腔注射5d。停藥后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤稱重后置于福爾馬林液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2.2 指標檢測 抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.3 病理學檢查 取石蠟包埋組織，切片、HE染色，光鏡下觀察腫瘤的病理變化。

1.2.4 免疫組化檢測Bcl-2蛋白表達 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。PBS洗3次，2min/次;0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶10min;蒸餾水洗3次，2min/次。熱修復(fù)抗原，放入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min，反復(fù)2次，冷卻后PBS洗3次，2min/次;滴加一抗，濃度為1:50，4℃過夜，PBS洗3次，2min/次;滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，37℃ 40min，PBS 洗 3 次，2min/次;滴加 SABC，37℃ 20min，PBS洗4次，5min/次;DAB 顯色，室溫 5～15 min，蒸餾水洗滌5min;蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

結(jié)果由病理科醫(yī)師協(xié)助分析，胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bcl-2陽性細胞。即根據(jù)每張切片的陽性細胞比例及著色深淺積分，兩者乘積判斷陽性等級，每例組織觀察3個連續(xù)切片，每片采樣3個400倍視野計數(shù)，陽性細胞所占的百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細胞10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為＞75%。再將染色強度打分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。將染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分為免疫組化結(jié)果(+)。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件包，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，采用方差分析。率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 阿拉瑞林對移植瘤重量、抑瘤率的影響(表1)。用藥過程中，裸鼠生長良好(圖1)。

表1 各組的瘤重及抑瘤率比較()

表1 各組的瘤重及抑瘤率比較()

注:△P＜0.01vs對照組;＊P＜0.01vs阿拉瑞林組

組別 例數(shù) 平均瘤重(g) 抑瘤率(%)對照組6 1.8451±0.2052 -阿拉瑞林組 6 1.4572±0.1845△ 21.025-FU組 6 1.2650±0.1675△＊ 31.44聯(lián)合組 6 0.8127±0.1533△＊55.95

圖1 治療中的裸鼠

表2 各組免疫組化bcl-2的表達比較(例，%)

2.2 阿拉瑞林對裸鼠移植瘤組織形態(tài)學觀察 對照組瘤細胞密集，細胞有明顯異型性，核大深染，可見較多核分裂像，間質(zhì)較少。治療組瘤細胞排列較稀疏，可見大片無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，瘤細胞核深染、固縮。

2.3 免疫組化檢測Bcl-2蛋白表達結(jié)果(表2、圖2)。

3 討論

阿拉瑞林是對天然的促性腺激素釋放激素(GnRH)分子結(jié)構(gòu)進行修飾而合成的肽類物質(zhì)，對人體無毒，作用時間比GnRH長久。因為它能與垂體中特異性受體結(jié)合，抑制促性腺激素和性激素的釋放，造成性腺功能低下，因此，對與性激素有關(guān)的疾病具有良好的治療作用，對于惡性腫瘤，有直接抑制腫瘤細胞增殖、加速其死亡的作用［4］。目前它已成功用于治療乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌［5］等激素依賴性腫瘤。本實驗中，各實驗組平均瘤重與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，阿拉瑞林組、5-FU組及聯(lián)合組兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.05)。說明阿拉瑞林對子宮內(nèi)膜癌有抑制作用，且阿拉瑞林與5-FU在抑制腫瘤生長方面有協(xié)同作用。

Bcl-2為凋亡抑制基因，編碼Bcl-2，與細胞凋亡關(guān)系密切［6］，可穩(wěn)定細胞內(nèi)質(zhì)膜系統(tǒng)、抑制線粒體內(nèi)離子及細胞色素C的釋放從而抑制凋亡的發(fā)生，Bc1-2過量表達，抑制細胞死亡［7］。Bax具有對抗Bc1-2抑制細胞凋亡的作用，在細胞內(nèi)，Bcl-2和bax可以分別形成同源二聚體，也可以互相聚合形成異源二聚體。當細胞接受某些刺激信號后，如果bcl-2高表達，形成Bcl-2/Bax異二聚體增加，細胞免于凋亡;如果Bax高表達，形成Bcl-2/Bax同源二聚體增加，細胞發(fā)生凋亡。本實驗中發(fā)現(xiàn)，阿拉瑞林處理的子宮內(nèi)膜癌細胞中Bcl-2蛋白表達減少，提示可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達，進而誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的發(fā)生，可能的作用機制有待進一步研究。實驗中還顯示阿拉瑞林與5-FU聯(lián)合在誘導腫瘤細胞凋亡過程中Bcl-2表達明顯下調(diào)，提示兩藥合用具有協(xié)同抗腫瘤作用，因此阿拉瑞林與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用可望降低化療藥物劑量而達到相同的療效，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供更為有效的方法。

圖2 bcl-2免疫組化(SABC×400)

［1］Kao MS. Management of recurrent endometrial cancer. Chang GungMed J，2004，27: 639-645.

［2］張超，劉欣燕.GnRH的臨床應(yīng)用進展.中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2007，8(3):229-231.

［3］張玉泉，曹斌融，張惜陰，等.丙氨瑞林對子宮內(nèi)膜癌ras、myc及p53基因表達調(diào)控的研究.南通醫(yī)學院學報，1999，19(1):19.

［4］田玲，路學智.瑞林類人工合成肽類藥物的研究進展.中國新藥雜志，2006，15(20):1723-1726.

［5］徐虹，宋磊.子宮內(nèi)膜癌的激素治療進展.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2007，16(1):62-64.

［6］Shang L，Wwang L，Sun H L，et al. Protective effects of oxyma trineon myocyte apoptosis in rats with acute myocardial ischa ania. ChinPharm J( 中國藥學雜志) ，2007，42( 7) : 501-504.

［7］Fan J，Li R，Zhang R，et al. Effect of Bcl-2 and Bax on survival ofside population cells from hepato cellular car-cinoma cells. World JGastroenterol，2007，7: 6053-6059.