人乳頭瘤病毒18型E6蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在子宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中的表達(dá)

衛(wèi) 瑩,朱 靖,王青元,范少君,李 敏,肖衛(wèi)華,凌 斌,周 穎

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科分子實驗室安徽省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室,安徽合肥230001;2.中國科技大學(xué)生命科學(xué)院免疫學(xué)研究所)

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的最重要危險因素之一,高危型HPV,如HPV16和18的感染在宮頸癌中最常見,其E6基因及產(chǎn)物常常導(dǎo)致細(xì)胞基因失活、變異和異常表達(dá),最終誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞永生化,是最主要的癌蛋白編碼基因[1]。近年來對E6蛋白的研究逐步深入,但是E6蛋白在子宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平很低,很難檢測[2]。本文將HPV18E6基因克隆到3×flag真核表達(dá)載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6,經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中,為進(jìn)一步研究HPV18E6在宮頸癌發(fā)病中的作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TakaRa公司,DEPC購自Sigma公司,TaqDNA聚合酶購自 TakaRa公司,pMDTM18-T Vector購自TaKaRa公司,小劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司,限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SalⅠ及DNA連接酶均購自Fermentas公司,大腸肝菌菌株E.coli DH5α購自上海生工生物工程有限公司,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen公司,HPV18E6抗體購自santa cruz公司,GAPDH抗體購自Cell signaling公司,flag抗體購自sigma公司,Western-blot化學(xué)發(fā)光底物購自PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 參考GenBank中HPV18E6堿基序列,采用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行分析后設(shè)計出18E6上下游引物:P1:GCGCGCTTTGAGGATCCAA;P2:TTATACTTG T GTTTCTCTGCGTCG.Fw1:CCCaagctt GCGCGCTTTGAGGATCCAA(HindⅢ);Rv1:GCGTCGAC TACTTGTG TTTCTCTGCGTCG(SalⅠ);分別加入了HindⅢ、SalⅠ酶切位點(劃線部分)。用Trizol法從Hela細(xì)胞中提取總RNA,以O(shè)ligod(T)18為逆轉(zhuǎn)錄引物,以提取的總RNA為模板,在M-mlv反轉(zhuǎn)錄酶催化下反轉(zhuǎn)錄出cDNA。取 2 μ l cDNA為模版,采用Takara Ex TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR,擴增目的基因。反應(yīng)條件:94℃5 min 1個循環(huán),94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s共35個循環(huán),72℃10 min 1個循環(huán)。取15 μ l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳。依據(jù)TaKaRa膠回收純化試劑盒操作規(guī)程,膠回收純化目的片段,回收成功后將目的片段連接到pMD-18T載體中,轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒測序鑒定正確后,以pMD-18T-18E6為模板,經(jīng)Fw1,Rv1引物擴增得到編碼區(qū)片段。將18E6編碼區(qū)片段與載體分別用HindⅢ、SalⅠ酶切,膠回收獲得載體片段和HPV18E6片段,然后用DNA連接酶,20℃連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)大腸桿菌,涂板(氨芐霉素抗性),37℃生長16 h-24 h,長出菌斑約100個,挑出14個菌斑溶于1 ml氨芐霉素抗性的LB培養(yǎng)基中少量搖菌12 h,取2 μ l作為模板進(jìn)行PCR,有四個克隆擴增出HPV18E6片段,陽性的菌液加入氨芐霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩搖菌,37℃過夜。參照Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒操作規(guī)程提取純化p3×flagmyc-CMV-24-HPV18E6,HindⅢ、SalⅠ酶切質(zhì)粒,電泳鑒定,鑒定證實后的細(xì)菌擴增培養(yǎng),提取質(zhì)粒,送到上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞 將人子宮頸癌細(xì)胞株Hela種到 6孔板中,每孔2×105,完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后用DMEM 洗滌2次,分別將p3×flagmyc-CMV-24-HPV18E6質(zhì)粒、p3×flag-myc-CMV-24對照質(zhì)粒各 4 μ g,脂質(zhì)體 Lipofectamine2000 10 μ l/孔 。轉(zhuǎn)染6 h后,更換完全培養(yǎng)基,48 h后收取細(xì)胞。

1.2.3 蛋白的提取及Western-blot檢測 收取轉(zhuǎn)染細(xì)胞,冷PBS洗3次后,加入30 μ l RIPA(臨用前加入PMSF、抑蛋白酶肽)冰上30 min,4℃12 000 rpm離心30 min,移上清至一新的微量離心管,蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,經(jīng)封閉2小時后一抗 flag(1∶1 000)或 GAPDH(1∶1 000)或HPV18E6(1∶50)4℃過夜,TBS-T洗后加入相應(yīng)的二抗孵育2小時,膜經(jīng)TBS-T洗后與ECL發(fā)光檢測劑結(jié)合,經(jīng)X片壓片曝光,顯示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HPV18E6的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 DNA marker為DL2000標(biāo)準(zhǔn)參照物,PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示在500 bp的一條特異性目的片段,與所設(shè)計的HPV18E6目的基因片段大小一致(圖1)。

圖1 HPV18E6目的基因片段電泳圖

2.2 p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6重組質(zhì)粒酶切鑒定、測序 經(jīng)HindⅢ和SalⅠ雙酶切后出現(xiàn)分子量分別為4 700 bp和500 bp的2條帶,正好與質(zhì)粒p3×flag-myc-CMV-24和HPV18 E6基因的分子量一致(圖 2)。將重組質(zhì)粒 p3×flag-myc-CMV-24-HQV18E6送到上海生工生物有限公司測序,測序結(jié)果均與目的序列完全相同,表明構(gòu)建載體成功。

圖2 HPV18E6目的基因片段電泳圖及p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6酶切鑒定

2.3 p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,E6蛋白和flag標(biāo)簽的表達(dá)情況p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48 h后,Western blot檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組E6蛋白顯著升高并可檢測到flag標(biāo)簽(圖3)。

圖3

3 討論

目前,子宮頸癌發(fā)病率居高不下,且發(fā)病年齡趨于年輕化,宮頸癌發(fā)病與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān),HPV為雙鏈環(huán)狀DNA,其片段長度約為8.0 kb,編碼6個早期蛋白和2個晚期蛋白,HPV通過抑制一系列的靶蛋白,如腫瘤抑制因子,避免了被感染細(xì)胞的凋亡,從而使細(xì)胞處于永生化狀態(tài)[3、4]。其中 E6、E7是HPV 致癌的關(guān)鍵分子,在宮頸癌組織中持續(xù)表達(dá),能促使宿主細(xì)胞進(jìn)入增殖周期而導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制,在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。HPV E6蛋白由151個氨基酸殘基組成,含有2個鋅指結(jié)構(gòu),每個鋅指結(jié)構(gòu)含有2個C-X-X-C序列,鋅指結(jié)構(gòu)是E6發(fā)揮功能所必需的[5]。高危型HPV E6與E7相互作用使人類的角質(zhì)形成細(xì)胞永生化,并通過作用于ras致癌基因從而使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[6]。E6蛋白是HPV感染過程中最早表達(dá)的蛋白之一,通過招募E6AP泛素酶形成復(fù)合體,然后與p53核心部分相結(jié)合,E6將活化的泛素轉(zhuǎn)移到p53蛋白,p53進(jìn)行泛素化降解,使p53蛋白控制的G1/S節(jié)點失去控制,導(dǎo)致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定和基因突變增加以及外源DNA整合到染色體中機率大大升高[7、8]。此外,E6還可與細(xì)胞內(nèi)許多蛋白相互作用而協(xié)同參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程:如抑制宿主細(xì)胞凋亡、激活端粒酶等對宮頸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及細(xì)胞永生化過程有重要作用[9]。但由于E6蛋白在子宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中的表達(dá)水平太低,很難用Westernblotting等方法檢測[2],阻礙了我們對其致癌機制的進(jìn)一步研究。

隨著組蛋白學(xué)的迅速發(fā)展,重組蛋白質(zhì)的應(yīng)用近年來大大增加,重組蛋白雜合體含有一個多肽融合擔(dān)體也就是親和標(biāo)簽可用于輔助目標(biāo)蛋白的檢測。Flag標(biāo)簽系統(tǒng)是利用一短的親水8氨基酸肽并融合到目標(biāo)蛋白,常標(biāo)記于重組蛋白質(zhì)的氨基端以幫助分析靶蛋白的生物學(xué)功能,并且可以用專門的單抗進(jìn)行檢測[10]。為了進(jìn)一步提高flag標(biāo)簽的檢測能力,目前常用3×flag標(biāo)簽系統(tǒng),這一三聯(lián)體flag抗原表位是親水性的,由22個氨基酸組成,可以檢測表達(dá)低至10 fmol水平的融合蛋白。而且研究發(fā)現(xiàn)使用這些很小的肽標(biāo)簽不會對融合蛋白質(zhì)的功能及定位發(fā)生干擾。此外,含CMV啟動子可以高效啟動目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá),進(jìn)一步有助于目的蛋白的檢測。

本實驗中利用親和標(biāo)簽flag對目的蛋白進(jìn)行檢測和監(jiān)測的方法,將已合成的p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6質(zhì)粒導(dǎo)入子宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中,并對其蛋白復(fù)合物進(jìn)行檢測,不僅提高了E6蛋白的表達(dá)量,通過flag標(biāo)簽系統(tǒng)使得E6蛋白更易于檢測,為進(jìn)一步研究HPV18E6蛋白及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)功能及其在子宮頸癌中所發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

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