石蒜中加蘭他敏的提取工藝研究

令狐昱慰， 李思鋒， 黎 斌， 簡 強， 李多偉

（1.陜西省西安植物園，陜西西安 710061;2.第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院，陜西西安 710032;3.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069）

加蘭他敏（Galanthamine）系從石蒜屬植物中分離得到生物堿，是一種可逆性膽堿酯酶抑制劑。近年來被用于治療阿爾茨海默?。ˋD）和血管性癡呆（VD）、酒精和尼古丁依賴等癥。由于其副作用小，因此引起了廣大研究者的興趣。本文以提取溫度、提取時間、溶劑濃度及料液比為參數(shù)，通過正交設(shè)計優(yōu)化加蘭他敏的提取工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)加蘭他敏提供可靠依據(jù)。

1 儀器和材料

儀器:高效液相色譜系統(tǒng)，包括1525型液壓橫波泵、2487型雙通道UV檢測器和Breeze數(shù)據(jù)處理軟件（美國Wa－ters公司）;三用恒溫水浴箱（河北省黃驊航天儀器廠）;FA1004電子天平（上海天平儀器廠）。

試劑:氫溴酸加蘭他敏對照品，（批號050－7801）由陜西省藥品檢驗所提供。石蒜，由陜西江興醫(yī)化科技有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 加蘭他敏HPLC含量測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil 100A C18反相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相:乙腈－磷酸緩沖液（15∶85），檢測波長:290 nm。

2.1.2 標準曲線的制備

分別精密吸取濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液0.5、1、1.5、2.5 mL，加甲醇稀釋至 10 mL，制成 0.05、0.10、0.15、0.25 mg/mL的標準液。再取0.05、0.1、0.2 mL對照品溶液稀釋至 10 mL，制成 0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL的標準液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按上述色譜條件測定，以對照品進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，作圖，得回歸方程:Y= －19 706.254 69+6 127 680X，r=0.999 31，加蘭他敏在0.05～2.5 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 樣品液加蘭他敏含量測定

精密吸取樣品液1.0 mL，用甲醇定容至10 mL量瓶中，按標準曲線的制備方法測定樣品峰面積，計算含量。

2.2 提取方法的選擇

2.2.1 冷浸提取法

稱取石蒜干粉70 g，用1 000 mL 1%的鹽酸浸泡過夜，4 500 r/min離心20 min，將上清液減壓濃縮至小體積，飽和碳酸鈉調(diào)pH至8左右，氯仿萃取，萃取濃縮液備用。

2.2.2 熱回流提取法

稱取石蒜干粉70 g，用500 mL 85%的乙醇熱回流提取3次，提取液減壓濃縮后用飽和碳酸鈉調(diào)pH至堿性，氯仿萃取，萃取液濃縮至干，用5%HCl溶解殘渣，過濾，濾液再用飽和碳酸鈉調(diào)pH至8左右，氯仿萃取，萃取濃縮液備用。

2.2.3 超聲波輔助提取法

稱取石蒜干粉70 g，用500 mL 85%乙醇于高頻超聲波水域中萃取3次，每次1 h，并且每半小時間隔5 min，合并提取液，抽濾，濾液用飽和碳酸鈉調(diào)pH至8左右，氯仿萃取，萃取濃縮液備用。

上述3種提取方法的提取結(jié)果見表1。

表1 加蘭他敏提取方法與含量關(guān)系

2.3 熱回流提取法的條件優(yōu)化

從表1可知熱回流提取法優(yōu)于其他兩種方法，故選取熱回流提取法進行正交試驗。采用L9（34）正交表，考察提取溫度、乙醇濃度、提取時間和料液比4個影響因素，優(yōu)化加蘭他敏的最佳工藝條件。正交設(shè)計見表2，正交試驗結(jié)果見表3和表4。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗L9（34）結(jié)果分析（n=2）

2.4 驗證試驗

按照篩選得到的最佳工藝制備樣品3批，測定3批樣品的平均提取率為68.825%，與正交試驗結(jié)果相近。

表4 加蘭他敏提取率方差分析結(jié)果

3 結(jié)果和討論

3.1 不同提取工藝均能用于石蒜中加蘭他敏的提取，但從各種工藝的比較結(jié)果可見，熱回流提取法得到的加蘭他敏提取率明顯高于冷浸提取法和超聲波輔助提取法。

3.2 結(jié)合表3和表4中的結(jié)果，由直觀分析可知，各因素的主次順序為B＞A＞D＞C，即乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間，說明熱回流提取法中對加蘭他敏提取率影響最大的是乙醇濃度。從方差分析結(jié)果可知:B因素有顯著性意義（P＜0.05），B選水平3，即95%的乙醇濃度;A因素次之，A選水平3，即溫度為85℃;C因素和D因素無顯著性意義（P＞0.1），從節(jié)省時間和能源角度考慮，分別選水平2和1為宜。綜合上述分析，最佳提取工藝應為A3B3C2D1，即用5倍量95%乙醇85℃熱回流提取3次，每次2 h。

3.3 用熱回流法提取加蘭他敏雖然取得了較好的效果，但是由于原料含量的限制，一直未能得到加蘭他敏晶體，所以如何提高加蘭他敏產(chǎn)品純度，采取哪種結(jié)晶方法是我們需要進一步研究的內(nèi)容。

3.4 加蘭他敏具有防治阿爾茨海默病的作用，目前已受到醫(yī)療及保健行業(yè)的廣泛關(guān)注。本試驗既能實現(xiàn)投資小、能耗低，又能得到較高的提取率，工藝路線簡單可行，可作為工業(yè)化生產(chǎn)加蘭他敏的參考依據(jù)。

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