青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理及TNF-a表達的影響

方 敬， 陳志強， 范煥芳， 閆翠環(huán)

（河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，河北石家莊 050017）

系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是一種免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)性疾病，是指以腎小球系膜細胞增生和細胞基質(zhì)積聚為主要病理改變的一類腎小球疾?。?］，近幾年國內(nèi)有報道，青藤堿可以減輕腎小球炎癥反應(yīng)的作用，并且副作用小，沒有肝損害。本實驗旨在通過觀察青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)及腫瘤壞死因子－a（TNF－a）表達的影響，探討青藤堿在MsPGN病理過程中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年♂SD大鼠，體重（130±170）g，共40只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:冀醫(yī)動管字第04057。

1.2 試劑 兔抗大鼠TNF－a多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）;SP（二抗為羊抗兔）試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。TNF－a引物上游:5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，下游 5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，（北京賽百盛工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.3 模型制備 動物隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、青藤堿組、雷公藤多苷組，采用改良的慢性血清病性MsPGN模型，10%的水合氯醛麻醉后，經(jīng)背部切除左側(cè)腎臟，在每只大鼠背部皮下分點注射完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3 mg，于第1、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3 mg，3周后腹腔注射BSA連續(xù)4次，每次間隔 1 h，注射劑量每只分別為0.5、1、1.5、3.0 mg，次日每只腹腔注射BSA 2 mg。第4周正式免疫:尾靜脈與腹腔注射隔日進行，每只大鼠尾靜脈注射BSA劑量從0.5 mg開始，每次增加0.5 mg，至2.5 mg為止，繼續(xù)每周加量0.5 mg，至每日用量5 mg為止，腹腔注射量是尾靜脈注射量的1倍，至每日用量10 mg為止，免疫兩周后尾靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS）100 μg/只，全部大鼠于正式免疫8周后處死取腎組織。

1.4 實驗用藥及方法 采用直接灌胃方法，于實驗第4周開始灌胃給藥，每日1次，青藤堿組采用正清風(fēng)痛寧（白云山正清制藥股份有限公司 批號:9911105），服藥量為30 mg/（kg·d），按成人/（kg·d）劑量的15倍給藥;雷公藤多苷（TWP）組采用雷公藤多苷片（湖南省株洲市制藥三廠 批號:Z43020138）服藥量為20 mg/（kg·d），按成人/（kg·d）劑量的15倍給藥，正常組灌以相應(yīng)量的自來水。各組灌胃共4周。

1.5 腎組織標(biāo)本制作及觀察

1.5.1 光鏡 實驗第8周末，無菌下取右腎組織，HE、PAS染色，鏡下觀察并拍片。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法觀察腎小球中TNF－a的變化，并進行半定量分析。腎小球內(nèi)表達:采用HMIAS－2000型高清晰度彩色病理圖象分析系統(tǒng)，每組選取6只大鼠標(biāo)本，每個標(biāo)本測量10個完整腎小球進行半定量分析。腎小管的表達:選用標(biāo)本數(shù)及分析系統(tǒng)同上。檢測每張切片10個視野，計算每個視野陽性染色面積以及顯示屏面積，陽性染色面積和顯示屏面積的比值表示相對含量。

1.5.3 逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈反應(yīng)（RT－PCR） 引物的設(shè)計與合成:TNF－α、內(nèi)參照β－actin的引物設(shè)計用PrimerPremier5.0引物設(shè)計軟件自行設(shè)計完成，由北京賽百盛生物工程公司鑒定并合成。TNF－α的上下游引物序列分別為5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，5’－GTC GTA GCA AAC CAC CAA G－3’，擴增的基因片段長度為214 bp。混勻，8 000 r/min離心30 s。PCR儀目的基因和內(nèi)參照同管擴增，反應(yīng)條件:以95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃35 s，30循環(huán)，72℃延伸10 min。各組 PCR產(chǎn)物20 μl，gold view染色，2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠圖像定量分析系統(tǒng)成像，以β－actin為內(nèi)參照，應(yīng)用讀膠儀讀取各條產(chǎn)物帶的光密度值，并計算產(chǎn)物的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS11.5 for windows統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析法對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察結(jié)果 正常組腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細血管腔開放，系膜區(qū)的寬度小于血管直徑，腎小管、間質(zhì)無異常。模型組腎小球系膜區(qū)明顯增寬，系膜基質(zhì)增多，腎小球毛細血管腔受壓變窄或閉塞。部分腎小管上皮細胞腫脹、管腔狹窄，間質(zhì)有炎細胞浸潤。青藤堿組和雷公藤多苷組腎小球系膜區(qū)的寬度明顯小于模型組，其寬度等于或小于毛細血管腔直徑，腎小球毛細血管腔呈開放狀態(tài)。

2.2 免疫組化檢驗結(jié)果（表1） 正常組腎組織中腎小管僅呈微弱陽性反應(yīng)，腎小球呈陰性反應(yīng);模型組在腎小球及腎小管中分布的范圍和強度明顯擴大和增強;青藤堿組表達明顯降低（與模型組P＜0.01），兩治療組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）

表1 免疫組化檢驗結(jié)果（±s）

表1 免疫組化檢驗結(jié)果（±s）

與模型組比較，##P＜0.01。

組別 樣本數(shù)/個 腎小球 腎小管正常對照組模型組青藤堿組雷公藤多苷組6666 1.09±0.27 10.03±2.99 4.52±0.64##4.68±0.55##1.11±0.50 12.11±3.76 5.74±1.38##5.32±1.11##

2.3 RT－PCR結(jié)果（表2） 各組腎組織的TNF－αmRNA PCR產(chǎn)物電泳條帶則顯示不均一。正常組有基礎(chǔ)水平的TNF－αmRNA表達。提示MsPGN大鼠TNF－αmRNA表達存在明顯的上調(diào)。青藤堿組和雷公藤多苷組TNF－αmRNA表達明顯下調(diào)（與模型組P＜0.01），提示青藤堿可以抑制腎組織TNF－αmRNA的表達。兩治療組相比無顯著差異（P＞0.05）

表2 腎組織TNF-αmRNA的表達（±s）

表2 腎組織TNF-αmRNA的表達（±s）

與模型組比較，#P＜0.05 ##P＜0.01。

組別 樣本數(shù)/個 TNF－α 0.32±0.02模型組 6 0.81±0.02青藤堿組 6 0.77±0.03#雷公藤多苷組 6 0.76±0.04 mRNA/%正常對照組6##

3 討論

我們選用鄒氏造模法并進行改良制備MsPGN模型［2］，實驗結(jié)果表明，青藤堿可以抑制腎小球系膜細胞增殖，系膜基質(zhì)積聚，延緩病變進展，其作用機制可能與該藥抑制TNF－a的表達有關(guān)。

TNF－a可以通過多種途徑作用于系膜細胞。首先TNF－a促進系膜細胞主要組織相容性抗原Ⅰ和Ⅱ表達，促進5’－核苷酸、促凝血物質(zhì)，糖蛋白合成;TNF－a與IL－1協(xié)同作用在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平刺激系膜細胞合成前列腺素和花生四烯酸，增強磷脂酶A活性，增強環(huán)氧化酶活性，使MC增殖、基質(zhì)增寬［3］;而且 TNF－a誘導(dǎo)系膜細胞產(chǎn)生血小板活化因子（PAF）［4］，影響腎臟血液循環(huán)的同時，也可改變腎小球系膜細胞的功能，使其發(fā)生細胞收縮，導(dǎo)致細胞形態(tài)和細胞骨架改變，刺激系膜細胞分裂增殖。此外，TNF－a本身的毒性作用可以造成系膜細胞變性及壞死性改變。

綜上所述，青藤堿通過下調(diào)TNF－a及TNF－amRNA的表達，從多種途徑作用于系膜細胞，改善MsPGN大鼠腎臟病理改變，延緩腎小球硬化。

［1］Nagler Aron，Helena Aingon A.Inhibion of glomerular mesangial cell proliferation and extracellular matrix deposition by halafuginone［J］.Kindey Int，1997，52:1561.

［2］賈 慧，鄒萬忠.改良慢性血清病性大鼠系膜增生性腎炎模型的建立［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，1996，5（3）:21－25.

［3］Watanabe K，Nakagawa H.Cytokines enhance the production of a chemotactic factor for polymorphonuclear leukocytes by rat venal glomerular epit helioid cells［J］.Nephron，1990，54:169.

［4］Camussi G，Turello E，Tetta C，et al.Tumor necrosis factor induces contraction of mesangial cells and alters their cytoskeletons［J］.Kidney Int，1990，38（5）:795－802.