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    一個(gè)低磷酸酶血癥家系的基因突變分析

    2010-05-25 01:43:44陳晨王麗波曹麗華邢雪莎王述森麻宏偉羅陽
    關(guān)鍵詞:雜合磷酸酶家系

    陳晨,王麗波,曹麗華,邢雪莎,王述森,麻宏偉,羅陽

    (中國醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組學(xué)教研室,沈陽 110001;2.附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科,沈陽 110004)

    低磷酸酶血癥(hypophosphatasia)是一種罕見的遺傳性疾病,以骨骼和牙齒礦化缺陷,血清和骨堿性磷酸酶活性持續(xù)低水平或缺如為主要特征。目前對本病尚無有效的治療方法。低磷酸酶血癥是由于肝/骨/腎堿性磷酸酶基因(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL;MIM#171760) 突變所致,ALPL基因定位于1p36.1[1],編碼的蛋白是組織非特異性堿性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNAP)。該病的遺傳方式較為復(fù)雜,呈常染色體顯性或隱性遺傳。本研究采集了一個(gè)低磷酸酶血癥家系中1例低磷酸酶血癥的患兒及其患病母親的血樣,采用PCR結(jié)合基因測序的方法尋找患者及其母親的ALPL基因突變位點(diǎn),進(jìn)一步確認(rèn)臨床診斷,同時(shí)探討患者發(fā)病的機(jī)制。

    到漢武帝劉徹即位時(shí),西漢儲備的糧食層層積壓,導(dǎo)致倉庫爆棚;國庫里銅錢積壓太多,導(dǎo)致穿錢的繩子朽壞,銅錢散落無法計(jì)算。有錢就任性的劉徹,終于敢對匈奴人說“不”了。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    本研究由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院發(fā)育兒科提供家系成員外周靜脈血及病例資料,系譜圖見圖1。共采集到該家系中Ⅳ-1和Ⅲ-2兩名成員的血樣,先證者Ⅳ-1為2009年就診于盛京醫(yī)院的患者,男,3.5歲,以“腿彎3年”為主訴就診,Ⅲ-2為先證者母親。

    1.2 方法

    1.2.1 臨床檢查:查體發(fā)現(xiàn)先證者Ⅳ-1身高96.5 cm(-1SD),“O”型腿,雙膝間距5 cm。實(shí)驗(yàn)室檢查中Ⅳ-1血堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)95.5 U/L(參考值40~375 U/L),血鈣、磷、鎂、甲狀旁腺素水平均正常。X線檢查發(fā)現(xiàn)雙側(cè)股骨頸干角變小,股骨頸略短,雙側(cè)髖內(nèi)翻,見圖2。Ⅲ-2的血ALP為19.5 U/L(參考值40~150 U/L),其他檢查結(jié)果正常。

    2~5歲兒童的皮膚發(fā)育過程具有一定的特殊性,其皮膚含水比例高, 在不同環(huán)境中的水分喪失速度較快,同時(shí)皮膚層內(nèi)的脂質(zhì)含量偏低,容易受到自身免疫性因子或者外界病原體的感染而出現(xiàn)真皮層的病變[4]。2~5歲兒童的發(fā)病率在不同的年齡階段中處于較高水平[5-6],部分東部沿海省份的相關(guān)流行病學(xué)研究顯示,2~5歲兒童不同類型皮膚疾病的總體發(fā)病率占到了其年齡段的第一位[7]。而皮膚病對于2~5歲兒童具有下列幾個(gè)方面的主要影響[8-9]:①對于兒童自信心的培養(yǎng)具有較為顯著的影響,增加了患兒自卑或者遠(yuǎn)期抑郁及焦慮的風(fēng)險(xiǎn);②導(dǎo)致患兒對于學(xué)習(xí)興趣的下降,影響到了其學(xué)習(xí)成績及自身性格的形成。

    1.2.2 提取基因組DNA:取患者Ⅳ-1和Ⅲ-2枸櫞酸鈉抗凝處理的外周靜脈血各200μl,選用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa)試劑盒提取基因組DNA,置于-20℃保存。

    將患者Ⅳ-1的ALPL基因雙向測序結(jié)果分別進(jìn)行序列比對分析(Human BLAT Search,http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat),發(fā)現(xiàn)患兒第12外顯子存在一個(gè)雜合突變c.1366G>A(p.G456R),即cDNA第1 366位G突變?yōu)锳,導(dǎo)致456位的甘氨酸變?yōu)榫彼幔妶D3。對患者母親ALPL基因第12外顯子進(jìn)行測序分析,結(jié)果顯示患者母親Ⅲ-2存在相同的雜合突變。

    2 結(jié)果

    1.2.3 PCR擴(kuò)增候選致病基因ALPL的外顯子并進(jìn)行測序分析:在UCSC網(wǎng)站獲得ALPL基因的DNA序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)覆蓋該基因編碼區(qū)(包括外顯子和內(nèi)含子交界區(qū))的引物,引物序列見表1。首先對先證者Ⅳ-1進(jìn)行檢測,PCR擴(kuò)增該基因的 12個(gè)外顯子,PCR反應(yīng)體系為 2×GC Buffer I (Mg2+Plus)25 μl,dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)8 μl,上下游引物終濃度為 0.5 μmol/L,TaKaRa LA Taq 2.5 U,基因組 DNA約 200 ng,加ddH2O至50μl,PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,切膠純化后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果利用UCSC數(shù)據(jù)庫對測得的DNA序列進(jìn)行核酸序列的同源性比對分析。在先證者基因水平檢測到突變后,同樣通過測序分析方法驗(yàn)證家系內(nèi)其他患者是否存在相同位點(diǎn)的基因突變。

    3 討論

    低磷酸酶血癥是一種以骨礦化缺陷和組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)活性減低為主要特征的遺傳性疾病,目前尚無根治方法,雖然有報(bào)道可以用自體間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因替代治療[2],但有效率和安全性尚待確定,因此基因診斷和遺傳咨詢顯得更為重要。低磷酸酶血癥致病基因ALPL定位于1p36.1,共包含12個(gè)外顯子,編碼524個(gè)氨基酸。參照人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database,HGMD)和國外學(xué)者建立的低磷酸酶血癥基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.sesep.uvsq.fr/03_hypo_mutations.php),到目前為止共報(bào)道了ALPL基因的218個(gè)突變,絕大部分為錯義突變,大約占79.3%,且突變主要集中在第5~6外顯子和第9~12外顯子。本研究中檢測到的該家系的p.G456R的雜合突變,位于第12外顯子,Ozono等[3]曾經(jīng)報(bào)道過該突變并對其進(jìn)行體外重組實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果顯示p.G456R突變體導(dǎo)致堿性磷酸酶完全失去活性。

    在蔡家堡鄉(xiāng)、西山鄉(xiāng)、東山等鄉(xiāng)鎮(zhèn)建立馬鈴薯“青薯2號”“青薯9號”全膜覆蓋栽培技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)80hm2,平均產(chǎn)量3.58×104kg,總產(chǎn)量達(dá)286.4×104kg;實(shí)現(xiàn)收入3.22萬元·hm-2,總產(chǎn)值257.76萬元(按0.9元/kg計(jì)算);與露地常規(guī)栽培相比,增產(chǎn)0.85×104kg,增產(chǎn)率31.14%,增收0.77萬元·hm-2;新增產(chǎn)量68.0×104kg,新增產(chǎn)值61.2萬元。

    ALPL基因編碼的TNAP蛋白共分為4個(gè)功能區(qū)域,分別是冠區(qū)、酶激活位點(diǎn)、同源二聚體界面和鈣結(jié)合位點(diǎn),該蛋白通過形成同源二聚體而發(fā)揮活性。第456位的氨基酸靠近TNAP的同源二聚體界面,并且在哺乳動物中是十分保守的氨基酸,該位點(diǎn)由極性疏水性的甘氨酸變?yōu)閴A性的精氨酸,很可能影響TNAP的蛋白結(jié)構(gòu)和活性,因此初步認(rèn)為p.G456R是該家系中患者疾病表型的關(guān)鍵影響因素。根據(jù)患者Ⅳ-1和Ⅲ-2的年齡和生化檢查等臨床表現(xiàn),兩者在臨床表型上都屬于輕型,輕型低磷酸酶血癥可呈常染色體顯性或隱性遺傳。而在該家系中,根據(jù)系譜圖可知,疾病在該家系中呈常染色體顯性遺傳,這與患者測序分析只檢測到一個(gè)雜合基因突變的結(jié)果吻合。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,檢測到一個(gè)突變等位基因的輕型低磷酸酶血癥患者多是(76.6%)由于雜合突變的顯性負(fù)效應(yīng)致?。?~6],而本研究中的p.G456R接近TNAP蛋白同源二聚體界面,因此推斷本家系更可能是由于雜合突變的顯性負(fù)效應(yīng),即影響了正常二聚體的形成而致病,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    表1 擴(kuò)增ALPL基因外顯子的引物序列Tab.1 Primer sequence of ALPL gene exons

    本研究在中國人群中首次報(bào)道了一個(gè)低磷酸酶血癥家系A(chǔ)LPL基因編碼區(qū)的雜合錯義突變c.1366G>A,進(jìn)一步豐富了基因突變數(shù)據(jù)庫,有助于深入了解該基因的結(jié)構(gòu)與功能,同時(shí)也確認(rèn)了患者的臨床診斷,為該家庭的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了可靠的依據(jù)。

    [1]Mornet E.Hypophosphatasia[J].Orphanet JRare Dis,2007,2:40-47.

    [2]Katsube Y,Kotobuki N,Tadokoro M,et al.Restoration of cellular function of mesenchymal stem cells from a hypophosphatasia patient[J].Gene Ther,2010,17(4):494-502.

    [3]Ozono K,Yamagata M,Michigami T,et al.Identification of novel missense mutations(Phe310Leu and Gly439Arg)in a neonatal case ofhypophosphatasia[J].JClin Endocrinol Metab,1996,81(12):4458-4461.

    [4]Delphine F,Isabelle B,Anne-Sophie L,et al.Mild forms of hypophosphatasia mostly result from dominant negative effect of severe allelesor fromcompound heterozygosity for severeand moderatealleles[J].BMCMed Genet,2009,6(10):51-59.

    [5]Muller HL,Yamazaki M,Michigami T,et al.Asp361Val mutant of alkaline phosphatase found in patients with dominantly inherited hypophosphatasiainhibitstheactivityof thewild-typeenzyme[J].JClin Endocrinol Metab,2000,85(2):743-747.

    [6]Lia-Baldini AS,Muller F,Taillandier A,et al.A molecular approach todominancein hypophosphatasia[J].Hum Genet,2001,109(1):99-108.

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