不同消化條件對(duì)小鼠胰島分離純化效果的影響

鐘嘉明，張佳林，李曉航，張成鈞，程穎，劉永鋒

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，肝膽外科暨器官移植科，沈陽(yáng) 110001）

胰島移植是治療1型糖尿病的一種理想方法。但目前臨床療效尚不理想，主要原因在于缺乏足夠數(shù)量的胰島、胰島移植后排斥反應(yīng)及胰島移植后早期功能丟失等問(wèn)題尚未解決［1］。因此，如何獲得足量、純凈且有良好活性的胰島非常重要。盡管胰島細(xì)胞分離與純化技術(shù)正在不斷改善，但獲得的胰島細(xì)胞在收獲量、活性及純度上仍然不盡人意［2］。由于影響胰島分離效果的因素較多，胰島的收獲量與純度難以同時(shí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。目前小鼠胰島分離方法主要采用經(jīng)膽道胰管逆行灌注膠原酶充分消化胰腺后，通過(guò)梯度離心法來(lái)分離純化胰島。本研究主要從膠原酶濃度和消化時(shí)間方面來(lái)探討如何提高小鼠胰島細(xì)胞分離純化后的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

8~12周BALB/c雄性小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)和中科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Hanks液自行配制；Eurocollins-Ficoll液、雙硫腙（dithizon，DTZ）、吖啶橙（acridine orange，AO）和碘化丙錠（propidium iodide，PI），均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；膠原酶P和HEPES，購(gòu)于德國(guó)Boehringer Mannheim公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 胰島分離：Balb/c小鼠共15只，非禁食，用乙醚吸入性麻醉后四肢固定，噴灑75%乙醇消毒胸腹部，腹部楔形切開(kāi)，暴露腹腔，沿十二指腸找到膽總管。近十二指腸處結(jié)扎膽總管，“破心”處死小鼠，用27G靜脈注射針經(jīng)膽總管分別逆行灌注濃度為0.5、1.0和1.5 mg/ml膠原酶P溶液3~4 ml。當(dāng)胰腺膨脹后迅速剪取胰腺，置入含3ml膠原酶P溶液（1 mg/ml）的離心管（50 ml）中，于37℃恒溫水浴箱中邊振蕩邊消化，分別消化20、25和30min，然后加入4℃含5%胎牛血清和10mmol/LHEPES的Hanks液稀釋并終止消化，4℃條件下800rpm離心2min，洗3遍。

1.2.2 胰島純化：將上述分離的胰島沉淀物加入3 ml密度為1.110的Eurocollins-Ficoll液，充分混勻，隨后依次緩慢加入密度為 1.096（3 ml）、1.074（2 ml）和1.069（2 ml）的Eurocollins-Ficoll液，最后加入Hanks液2 ml，4℃條件下2 000 rpm離心20 min，吸取1.069~1.074及1.074~1.096界面上的細(xì)胞團(tuán)，Hanks液洗3遍。純化的胰島細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 胰島形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)：采用DTZ染色法觀察計(jì)數(shù)，DTZ為螯合指示劑，可與含鋅的胰島B細(xì)胞螫合而使胰島呈猩紅色［3］，其他外分泌腺細(xì)胞不著色。用100μl加樣器在胰島懸液中重復(fù)取樣3次，分別置于24孔板內(nèi)，加入少量DTZ染液，混合后室溫下孵育l0 min，鏡檢計(jì)數(shù)DTZ陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)數(shù)，按以下公式計(jì)數(shù)胰島：胰島數(shù)=3次陽(yáng)性總數(shù)÷3×10×樣本量（m1），將1個(gè)直徑為150μm的胰島團(tuán)塊稱為1個(gè)胰島當(dāng)量（islet equivalent，IEQ）。

1.2.4 胰島細(xì)胞活性測(cè)定：采用AO/PI熒光染色法判定胰島細(xì)胞活性。AO/PI溶液配制：用Hanks液配制儲(chǔ)存液 AO 為 670μmol/L，PI為 750μmol/L，4℃避光保存。用前取0.01 ml AO與l ml PI混合，用Hanks液稀釋10倍，與胰島制備物混合10 min，在熒光顯微鏡下用490 nm激發(fā)光濾光片、510 nm光柵濾光片可同時(shí)見(jiàn)到綠色（AO）和紅色（PI）熒光，綠色標(biāo)記的為活細(xì)胞，紅色標(biāo)記的為死細(xì)胞。胰島細(xì)胞成活率用胰島活細(xì)胞占所有胰島活細(xì)胞和死細(xì)胞總數(shù)的百分比表示，每份標(biāo)本重復(fù)計(jì)算4次，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，用x±s表示。用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠原酶濃度及消化時(shí)間對(duì)胰島分離產(chǎn)量的影響

分離純化后的胰島細(xì)胞被DTZ染成猩紅色，鏡下表現(xiàn)為大小不一的圓形或卵圓形細(xì)胞團(tuán)和散在細(xì)胞（圖1）。膠原酶濃度和消化時(shí)間對(duì)胰島產(chǎn)量有重要影響，在膠原酶有效發(fā)揮活性的條件下（37℃、pH7.8、［Ca2+］7.5 mmol/L）［4］，當(dāng)膠原酶 P 濃度為 1.0 mg/ml、消化時(shí)間為25 min時(shí)胰島產(chǎn)量最高，與其他酶濃度和消化時(shí)間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同消化條件分離純化單個(gè)胰腺獲得的胰島數(shù)量（x±s）Tab.1 Islet yield of one pancreas under different digestive conditions（x ±s）

2.2 膠原酶濃度及消化時(shí)間對(duì)胰島分離純度和活性的影響

分離純化的胰島被AO/PI染成綠色或紅色（圖2）。當(dāng)膠原酶P濃度為1.0 mg/ml、消化時(shí)間為25 min時(shí)，純化后的胰島純度和活性均較其他消化條件高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

表2 不同消化條件分離純化胰島的純度和成活率（x±s）Tab.2 Islet purity and viability after different digestive conditions（x ±s）

胰島移植物的數(shù)量和純度是決定移植成功與否的關(guān)鍵因素［5］。胰腺由內(nèi)分泌部分胰島和外分泌部分胰腺腺泡組成，胰島散在于胰腺的腺泡實(shí)質(zhì)中，其總體積僅占整個(gè)胰腺的1%～2%，因此胰島分離需將其從豐富的外分泌腺泡中分離開(kāi)來(lái)。消化是胰島分離過(guò)程中最重要的一步，通過(guò)膠原酶消化可以使胰腺內(nèi)分泌腺和外分泌腺完全分開(kāi)；當(dāng)胰島被完全消化下來(lái)時(shí)再進(jìn)行純化，才可有效保證胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量，從而獲得較純的、有活性和功能的胰島細(xì)胞。

本研究通過(guò)采用不同濃度膠原酶灌注和不同消化時(shí)間，探討如何提高小鼠胰島分離純化后的產(chǎn)量、純度和活性。有研究表明，經(jīng)膽總管灌注膠原酶后進(jìn)行胰腺消化，分離純化后的胰島細(xì)胞在產(chǎn)量、純度和活性方面均明顯高于其他灌注方法（如經(jīng)膽囊灌注、間質(zhì)內(nèi)注射或不灌注）［6~8］。因此，本研究采用經(jīng)膽總管灌注膠原酶消化方法進(jìn)行胰島分離。經(jīng)膽總管灌注膠原酶后，一方面，通過(guò)機(jī)械擴(kuò)張破壞胰腺外分泌腺泡，能更好地消化外分泌腺組織；另一方面，膠原酶在胰腺內(nèi)外同時(shí)、同質(zhì)消化，可減輕對(duì)胰島的損傷，也為有效地純化胰島創(chuàng)造了條件，保證胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量［6，9］。然而，由于小鼠胰膽管細(xì)而薄，插管難度較大，無(wú)法保證均可成功插管，尤其是初學(xué)者插管技術(shù)尚未熟練時(shí)更易失敗。因此，成功插管進(jìn)行膽總管灌注是提高胰島產(chǎn)量和質(zhì)量的前提，可以借助解剖鏡進(jìn)行插管來(lái)提高成功率。為有效提高插管成功率，應(yīng)充分暴露膽總管，通過(guò)膽總管下端結(jié)扎可使膽總管膨脹而變得明顯，充分游離膽總管后進(jìn)行插管，有效固定針頭再進(jìn)行灌注，一般每個(gè)胰腺可灌注3~4 ml膠原酶。

胰腺消化是胰島分離的關(guān)鍵步驟，許多因素可以影響胰島產(chǎn)量和質(zhì)量，其中最重要的是膠原酶濃度和活性以及消化時(shí)間。目前最常用的是膠原酶V和膠原酶P，常用膠原酶濃度介于0.3~2.0 mg/ml。消化時(shí)間的把握對(duì)胰島產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要，如果消化時(shí)間過(guò)短，胰島將不能從胰腺組織中完全分離，其密度發(fā)生改變，使后續(xù)的純化過(guò)程中丟失大量胰島；反之，如果消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易破壞胰島，并產(chǎn)生膠狀物網(wǎng)羅大量胰島細(xì)胞團(tuán)，也影響胰島產(chǎn)量和質(zhì)量［10］。本研究探討了不同膠原酶濃度和消化時(shí)間對(duì)胰島分離純化的影響。為使膠原酶在最適條件下發(fā)揮高效的活性，我們?cè)O(shè)定消化溫度為37℃、膠原酶溶液 pH 7.8、［Ca2+］7.5 mmol/L，并用 10 mmol/L HEPES保持pH相對(duì)穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，在較高酶濃度下（1.5 mg/ml），雖然胰島能更徹底地從腺泡組織中釋放出來(lái)，但消化時(shí)間不好把握，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于胰島的純化并減少產(chǎn)量；在較低酶濃度下（0.5 mg/ml），胰島不易從腺泡組織中脫落，須延長(zhǎng)消化時(shí)間；在1.0 mg/ml的酶濃度下，消化時(shí)間相對(duì)比較好把握，振蕩消化25 min能獲得最高的胰島產(chǎn)量。需要注意的是，在消化過(guò)程中振蕩動(dòng)作應(yīng)輕柔，避免過(guò)度用力，否則也容易產(chǎn)生膠狀物并降低胰島產(chǎn)量和質(zhì)量。另外，不同類型、不同批號(hào)的膠原酶其酶活性是不一樣的［11］，即使是同一批酶，新鮮配置的酶溶液活性要強(qiáng)于配置后儲(chǔ)存的酶溶液。因此，在不同情況下，小鼠胰島分離條件的具體方案可能需做適當(dāng)調(diào)整以期達(dá)到最佳效果。

總之，影響胰島細(xì)胞分離純化的因素較多，包括膠原酶灌注方法的差異、不同消化酶的應(yīng)用、消化條件的不同程度地掌握以及操作人員熟練度等，這些因素始終貫穿著整個(gè)胰島細(xì)胞分離純化的過(guò)程，要提高胰島分離效果，關(guān)鍵在于對(duì)細(xì)節(jié)的把握和處理。本研究比較了不同膠原酶濃度和不同消化時(shí)間對(duì)小鼠胰島分離純化后產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，為小鼠胰島分離純化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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