可注射5-氟尿嘧啶緩釋凝膠體外釋放及其大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

郝堂娜，李鎮(zhèn)，喬明曦，范青，黃俊梓，陳大為#（.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，大連市 607；.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，大連市 607；.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽市 006）

近年來，環(huán)境敏感水凝膠作為一種智能高分子材料在設(shè)計(jì)和制備自調(diào)式給藥系統(tǒng)中扮演了重要角色。一般來講，此類物質(zhì)的合成主要以生物可降解性聚酯為原料，通過調(diào)節(jié)嵌段組成比例或加入符合要求的新嵌段來調(diào)控其物理、化學(xué)性質(zhì)，以控制藥物釋放速率、釋放部位等，達(dá)到不同的設(shè)計(jì)要求[1，2]。pH/溫度雙重敏感共聚物磺胺甲嘧啶低聚物/聚-ε-己內(nèi)酯-丙交酯/聚乙二醇嵌段共聚物（OSM1-PCLA-PEG-PCLAOSM1）作為智能給藥系統(tǒng)的一種優(yōu)良載體，是在溫度敏感嵌段共聚物聚-ε-己內(nèi)酯-丙交酯/聚乙二醇（PCLA-PEG-PCLA）的基礎(chǔ)上引入pH敏感單體磺胺甲嘧啶低聚物（OSM1），使其具備pH、溫度雙重敏感的性質(zhì)，克服了單純溫敏型聚合物注射過程中易堵塞、不適宜深層病變部位給藥等缺點(diǎn)，可以更靈敏地感知人體生理環(huán)境的變化[3]。

5-氟尿嘧啶（5-FU）自1957年由Heidelberg公司開發(fā)問世以來，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，主要適用于各種消化道癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌等的治療，在常見的惡性腫瘤如結(jié)腸癌、皮膚癌及乳腺癌，尤其是胃腸道腫瘤的治療中，至今尚無其它藥物可以代替[4]。因其脂溶性小，口服難吸收，個(gè)體差異大，靜脈給藥后血藥濃度迅速下降，t1/2僅為10～20 min，而且毒副作用較大，故其在臨床應(yīng)用中存在一定的局限性。因此開發(fā)和研制5-FU緩、控釋及靶向制劑已成為抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。與傳統(tǒng)的微粒制劑相比，緩釋凝膠作為藥物緩、控釋給藥系統(tǒng)顯示出較大的優(yōu)勢(shì)，尤其是以生物可降解高分子材料制備的緩釋凝膠，具有生物相容性好，毒副作用小，緩、控釋效果明顯，藥效維持持久等特點(diǎn)。筆者以pH/溫度雙敏生物可降解共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1為載體材料，制備了可注射5-FU緩釋凝膠。該制劑在室溫（25℃）、pH 8.0環(huán)境中以溶液形式存在，注入體內(nèi)后，隨著體內(nèi)環(huán)境（37℃，pH 7.4）的變化刺激產(chǎn)生應(yīng)答，形成凝膠，發(fā)揮緩釋作用。本文即對(duì)該制劑的體外釋放和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)規(guī)律進(jìn)行了初步的研究與探討。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AD高效液相色譜儀、SPD-10A型紫外檢測(cè)器（日本島津株式會(huì)社）；HW2000色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；ZRD6-B型藥物溶出儀（上海黃海藥檢儀器廠）；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)（上海菲洽爾分析儀器有限公司）；XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）。

1.2 試藥

5-FU（沈陽藥科大學(xué)制藥廠，批號(hào)：990605，含量：≥90.0%）；磺胺甲嘧啶（SM1，美國 Sigma公司，批號(hào)：55-46826-100 mg，含量：≥99.0%）；聚乙二醇（PEG 2000，上海浦東高南化工廠）；丙交酯（LA，北京康安高分子開發(fā)中心）；己內(nèi)酯（ε-CL，上海浩深貿(mào)易有限公司）；偶氮二異丁腈（AIBN，上海第四試劑廠）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，天津市博迪化工有限公司）；3-巰基丙酸（MPA，美國Alfa Aesar公司）；4-二甲基氨基吡啶（4-DMAP，上海市嘉辰化工有限公司）；二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，上海延長生化科技發(fā)展有限公司）；甲醇（色譜純，天津康科德科技有限公司）；對(duì)氨基苯甲酸（PABA，常州盛華化工有限公司）；磷酸二氫鉀（KH2PO4，廣東汕頭市西隴化工廠）；其余試劑均為市售分析純。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量140～150 g，購自沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2003-008。給藥前禁食12 h，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食。

2 方法

2.1 嵌段共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1的合成[5]

將SM1經(jīng)?；磻?yīng)得到?；a(chǎn)物（Sulfamerazine monomer，SM1M），以MPA為鏈延長劑，AIBN為鏈引發(fā)劑，采用自由基聚合法，合成OSM1。采用開環(huán)聚合法合成溫度敏感共聚物PCLA-PEG-PCLA，按一定摩爾比稱取上述2種合成產(chǎn)物適量，以DMF為溶劑，在偶聯(lián)劑4-DMAP和脫水劑DCC的作用下，經(jīng)脫水縮合反應(yīng)，得到嵌段共聚物OSM1-PCLA-PEGPCLA-OSM1。

2.2 可注射5-FU緩釋凝膠的制備

5-FU親水性較強(qiáng)，采用物理混合法制備緩釋凝膠。稱取5-FU原料藥和共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1適量，置于裝有磁力攪拌子的西林瓶中，加溶劑磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 8.0）適量，室溫（25℃）下攪拌溶解，使5-FU與共聚物溶解形成的膠束溶液充分平衡，即得5-FU共聚物溶液。

2.3 可注射5-FU緩釋凝膠體外釋放考察

取5-FU載藥量為0.5%、共聚物濃度為15%、20%和25%（W/W），共聚物濃度為25%、5-FU載藥量為0.2%、0.5%、1%（W/W）的凝膠溶液各1 mL，置于5 mL具塞玻璃試管中（釋放面積為0.50 cm2），每份樣品平行取3份。將試管放入溶出儀中，水浴溫度為37℃，待溶液完全形成凝膠后，向5-FU凝膠試管中加入3 mL釋放介質(zhì)（含有0.02%NaN3的pH 7.4的PBS）。調(diào)節(jié)溶出儀轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，在預(yù)定的時(shí)間取出全部釋放介質(zhì)，同時(shí)加入同體積的新鮮釋放介質(zhì)以保證漏槽條件。釋藥時(shí)間為9 d。將取出的含藥釋放介質(zhì)經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾、流動(dòng)相稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取20 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算累積釋放百分率。（1）色譜條件。色譜柱：Welch極限柱XB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水＝5∶95（V/V）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長：265 nm；進(jìn)樣量：20 μL。（2）方法學(xué)考察結(jié)果。5-FU檢測(cè)濃度線性范圍為20～100 μg·mL－1（r＝0.9997）；低、中、高濃度樣品加樣回收率分別為100.27%、100.78%、100.24%；日內(nèi)RSD分別為0.61%、0.39%、0.28%；日間RSD分別為0.92%、1.85%、0.86%。

2.4 大鼠體內(nèi)血藥濃度測(cè)定

（1）色譜條件。色譜柱：Phenonenex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-20mmol·L－1KH2PO4水溶液＝5∶95（V/V），加入0.01%的三乙胺后調(diào)節(jié)pH至5.5；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長：265 nm；進(jìn)樣量：20 μL。（2）生物樣品處理。在5 mL離心管中加入0.5 mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)PABA 20 μL，氮?dú)獯蹈伞＞芤迫⊙獫{0.2 mL置于離心管中，渦旋振蕩1 min，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5 min后，離心5 min（4000 r·min－1）。分離移取1.5 mL有機(jī)層至另一個(gè)1.5 mL尖底離心管中，40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，所得富集物?00 μL流動(dòng)相溶解，渦旋1 min，離心5 min（10000 r·min－1），取上清液20 μ L注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。（3）方法學(xué)考察結(jié)果。5-FU血漿檢測(cè)濃度線性范圍為0.5～60 μg·mL－1（r＝0.9983）；低、中、高濃度血漿樣品方法回收率分別為76.62%、86.71%、97.37%；萃取回收率分別為80.59%、76.94%、89.46%；日內(nèi)RSD分別為2.86%、2.78%、2.74%；日間RSD分別為1.96%、2.69%、0.74%。

2.5 5-FU緩釋凝膠大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)考察

（1）注射用藥液制備。參比制劑組為自制5-FU溶液劑，濃度為10 mg·mL－1；受試制劑組為5-FU緩釋凝膠，濃度為10 mg·mL－1；（2）給藥方案與樣品采集。將12只大鼠隨機(jī)分為2組，分別以每只10 mg的劑量皮下注射5-FU溶液和緩釋凝膠。受試制劑組于給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、9、12、24、48、72 h，由眼眶后靜脈叢取血約0.5 mL，置于事先涂有肝素的離心試管中，離心10 min（3500 r·min－1），取上層血漿，于－20 ℃冰箱中保存。參比制劑組于給藥后0.083、0.25、0.5、1、2 h，按上述操作分離血漿保存。采用“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定各組不同時(shí)間血藥濃度。

3 結(jié)果

3.1 藥物體外釋放結(jié)果

5-FU在共聚物濃度分別為15%、20%和25%的緩釋凝膠中釋藥曲線如圖1所示。

圖1 共聚物濃度對(duì)5-FU體外釋放的影響Fig 1 Effect of copolymers concentrations on in vitro release of 5-FU

圖1結(jié)果表明，5-FU在共聚物濃度為15%、20%、25%的緩釋凝膠中第9天時(shí)平均累積釋放百分率分別為89.66%、87.59%、80.85%。

5-FU在載藥量分別為0.2%、0.5%、1%的緩釋凝膠中釋藥曲線如圖2所示。

圖2 載藥量對(duì)5-FU體外釋放的影響Fig 2 Effect of drug-loading rate on in vitro release of 5-FU

圖2結(jié)果表明，5-FU在載藥量為0.2%、0.5%、1%的緩釋凝膠中第9天的平均累積釋放百分率分別為75.30%、80.85%、86.90%。

3.2 5-FU體外釋放模型擬合

5-FU在整個(gè)釋藥過程中釋藥速率均較快，將共聚物濃度為25%、載藥量為0.2%的緩釋凝膠中5-FU累積釋放百分率對(duì)時(shí)間分別進(jìn)行零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi動(dòng)力學(xué)方程和Ritger-peppas動(dòng)力學(xué)方程擬合[6]，結(jié)果見表1。

表1 5-FU體外釋放模型擬合Tab 1 In vitro release model fitting of 5-FU

由表1可以看出，5-FU的釋放曲線采用Higuchi動(dòng)力學(xué)方程擬合優(yōu)度相對(duì)較好，表明該制劑是以擴(kuò)散控制型為主的釋藥模式。

3.3 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)

根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度數(shù)據(jù)繪制的參比制劑組、受試制劑組的平均藥-時(shí)曲線見圖3。

圖3 皮下注射2種制劑后平均血藥濃度-時(shí)間曲線A.參比制劑；B.受試制劑Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of 5-FU after subcutaneous injection of two preparationsA.reference preparation；B.test preparation

采用統(tǒng)計(jì)矩非隔室動(dòng)力學(xué)理論對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的藥動(dòng)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中達(dá)峰時(shí)間tmax和達(dá)峰濃度Cmax由原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直接得出。以藥-時(shí)曲線尾部4個(gè)血藥濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行線性回歸，直線的斜率即消除速度常數(shù)Ke（h－1），t1/2可由公式t1/2＝0.693/Ke求得，AUC（0～t），AUC（0～∞）根據(jù)梯形法計(jì)算，計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 皮下注射2種制劑后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較Tab 2 Comparison of pharmacokinetic parameters of 5-FU after subcutaneous injection of two preparations

由表2中各參數(shù)可知，與參比制劑組相比，受試制劑組tmax有所延后，Cmax明顯下降，t1/2延長，AUC值明顯增加。

4 討論

4.1 體外釋放條件的選擇

對(duì)于可注射緩、控釋給藥系統(tǒng)而言，影響藥物從注射部位（皮下、肌內(nèi)、病變部位等）吸收的主要因素有：注射部位血流或淋巴流量；藥物的親脂性及顆粒溶解速度；藥物與載體貯庫的結(jié)合度；注射部位藥物貯庫的性狀和表面積等。本文所設(shè)計(jì)的共聚物OSM1-PCLA-PEG-PCLA-OSM1載藥水凝膠主要將其用于皮下或腫瘤部位注射。皮下環(huán)境血流量較少，注射部位藥物釋放速率主要由藥物從制劑中的釋放來控制，而不是由藥物吸收入血流的速率來控制。當(dāng)凝膠在體內(nèi)形成藥物貯庫后，藥物的釋放依賴于以下因素：貯庫中藥物的總量；藥物溶出的有效面積；藥物載體的性質(zhì)及藥物的理化性質(zhì)。因此筆者分別考察了共聚物載體濃度和載藥量對(duì)5-FU釋放的影響。在選擇體外釋放條件時(shí)，主要針對(duì)注射部位的生理?xiàng)l件，選用37℃、pH 7.4作為體外釋放條件。

4.2 共聚物濃度對(duì)藥物釋放的影響

從不同共聚物濃度藥物釋放曲線可以看出，釋放初期藥物的釋放速率與共聚物的濃度基本無關(guān)；隨后釋放速率隨共聚物濃度的增加略微降低。藥物包載在共聚物凝膠中，存在于不同的空間位置，部分分布在共聚物凝膠內(nèi)部深層區(qū)域，部分吸附在共聚物凝膠表層區(qū)域，釋放初期主要表現(xiàn)為吸附在表層的藥物釋放，因此釋放速率無明顯區(qū)別。隨后主要表現(xiàn)為凝膠內(nèi)部藥物的釋放，增加共聚物的濃度，溶液中膠束的數(shù)量隨之增加，進(jìn)而形成的凝膠結(jié)構(gòu)中膠束的數(shù)量也增加，膠束間距離縮短，深層區(qū)域藥物分子通過膠束間的擴(kuò)散速率受密集膠束產(chǎn)生的空間位阻影響較大，擴(kuò)散速率隨之降低，表現(xiàn)為釋藥速率降低[7]。5-FU體外釋藥均無明顯的突釋效應(yīng)，主要是由于共聚物溶液在形成凝膠以后進(jìn)行藥物釋放考察，膠面表層面積較小，表面吸附藥量較少，不足以造成突釋效應(yīng)。

4.3 載藥量對(duì)藥物釋放的影響

由不同載藥量的藥物釋放曲線可知，釋放初期藥物的釋藥速率均隨著載藥量的增加明顯加快。原因在于載藥量越大，凝膠表層吸附的藥物越多，釋放較快。釋放中期，隨著載藥量的增加，藥物釋放速率增大。當(dāng)5-FU載藥量逐漸增大時(shí)，分布在親水區(qū)域的藥物分子數(shù)目增多，其極易通過凝膠的親水性通道擴(kuò)散出去。而釋藥后期，親水區(qū)域過飽和狀態(tài)的藥物大部分通過擴(kuò)散方式釋放完全，余下包裹在共聚物膠束中的藥物主要通過共聚物的溶蝕、降解釋放，載藥量對(duì)釋藥速率無明顯影響。

4.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果比較

由表2中各參數(shù)可知，5-FU溶液組血藥濃度短時(shí)間達(dá)到峰值，隨后血藥濃度迅速下降，說明5-FU在體內(nèi)代謝迅速。而5-FU緩釋凝膠組經(jīng)皮下注射給藥后，與5-FU溶液組相比，tmax有所延后，Cmax明顯下降；從t1/2和AUC來看，緩釋凝膠組明顯大于溶液組，且體內(nèi)滯留時(shí)間延長，充分顯示了5-FU緩釋凝膠制劑皮下注射后具有良好的緩釋作用。

本文成功合成了pH/溫度雙重敏感共聚物OSM1-PCLAPEG-PCLA-OSM1，與單純溫敏型共聚物相比，可以更靈敏地感知人體生理環(huán)境的變化。利用該載體材料制備了水溶性藥物5-FU可注射緩釋凝膠，并對(duì)該制劑的體外釋放規(guī)律及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了初步的研究和探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與普通水溶液組相比，5-FU緩釋凝膠皮下注射后具有良好的緩釋效果，有望制備成供臨床應(yīng)用的緩釋制劑。

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