不同廠家炙朝鮮淫羊藿飲片主成分含量比較Δ

賈曉斌，金曉勇，王靜靜，邵振中，蘭雪蓮（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市 1013；.國(guó)家中醫(yī)藥管理局名方適宜劑型重點(diǎn)研究室，南京市 1008；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京市 1008）

淫羊藿為我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并記載于歷代本草。淫羊藿具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，臨床用于治療陽(yáng)痿、腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛等證，具有較好的療效。臨床用淫羊藿歷來(lái)均以炮制品為主，而炙淫羊藿飲片應(yīng)用最為廣泛，且療效極為顯著。炙淫羊藿飲片在2005年版《中國(guó)藥典》無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)[1]。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I等黃酮類成分是淫羊藿的主要活性成分。筆者收集了3個(gè)廠家的炙朝鮮淫羊藿飲片，建立了反相高效液相色譜（RP-HPLC）法用于同時(shí)測(cè)定淫羊藿中5種主要黃酮類成分，旨在為炙朝鮮淫羊藿飲片的質(zhì)量控制、資源利用和臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括600型泵、2996型自動(dòng)檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一分析電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；甲醇、乙醇（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水；淫羊藿苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110737-200312）；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I標(biāo)準(zhǔn)品（江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞98%）；炙品A（藥都集團(tuán)茗都中藥飲片有限公司，批號(hào)：080201）、炙品B（安徽滕王藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080501）、炙品C（亳州千草藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080401）均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定為炙朝鮮淫羊藿飲片真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫（0～13 min，乙腈22%；13～40 min，乙腈22%～78%；40～42 min，乙腈78%～22%；42～50 min，乙腈22%）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱定朝藿定A 8.58 mg、朝藿定B 9.13 mg、朝藿定C 8.27 mg、淫羊藿苷5.76 mg、寶藿苷I 5.73 mg對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）品，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，得0.858 mg·mL-1朝藿定A、0.913 mg·mL-1朝藿定 B、0.827 mg·mL-1朝藿定 C、0.576 mg·mL-1淫羊藿苷、0.573 mg·mL-1寶藿苷I貯備液。精密移取貯備液各1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，搖勻，加甲醇定容，搖勻，即得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I濃度分別為0.0858、0.0913、0.0827、0.0576、0.0573 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備[2]

取炙朝鮮淫羊藿飲片粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，加入75%乙醇溶液20 mL，精密稱定，超聲提取60 min，稱重后用提取液補(bǔ)足失重，過(guò)濾，減壓蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液4、5、10、20、30、40、50 μL依次進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得5種黃酮類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（見(jiàn)表1）。

表1 5種黃酮類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Tab 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of 5 kinds of flavonoids

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各對(duì)照品峰面積。結(jié)果，峰面積的RSD分別為朝藿定A 1.11%、朝藿定B 1.00%、朝藿定C 1.26%、淫羊藿苷1.29%、寶藿苷I 0.86%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一炙朝鮮淫羊藿飲片共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷I質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.90%、0.92%、2.18%、0.67%、1.27%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷及寶藿苷I峰面積的RSD分別為3.59%、1.43%、2.66%、1.12%、2.30%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品共9份，每份約0.1 g，精密稱定，依次加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷I貯備液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，準(zhǔn)確吸取10 μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿C、淫羊藿苷和寶藿苷I的平均回收率分別為99.77%、101.37%、101.45%、102.10%、99.00%，RSD分別為2.27%、1.62%、1.70%、1.17%、1.59%（n＝9）。

2.9 樣品含量測(cè)定

稱取不同廠家的炙朝鮮淫羊藿飲片各約0.2 g，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，準(zhǔn)確吸取10 μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。不同廠家炙朝鮮淫羊藿飲片中黃酮類成分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同廠家炙朝鮮淫羊藿飲片所含5種黃酮類成分的含量差別較大。寶藿苷I以炙品B的含量最高，是炙品A的5.5倍、炙品C的6.4倍。炙品B淫羊藿苷含量最高，分別高出炙品A、C16.1%、17.2%。炙品B的朝藿定B、朝藿定C略低于炙品A和炙品C中的含量，但是總體來(lái)說(shuō)，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量接近，朝藿定A的含量波動(dòng)范圍在3.61～4.26 mg·g-1，朝藿定B的含量波動(dòng)范圍在5.77～7.91 mg·g-1，朝藿定C的含量波動(dòng)范圍在2.47～2.97 mg·g-1。筆者認(rèn)為，不同廠家炙朝鮮淫羊藿飲片中5種黃酮類成分含量差別較大的原因是：來(lái)源不同的朝鮮淫羊藿藥材經(jīng)加工炮制成不同廠家的炙朝鮮淫羊藿飲片后，其5種黃酮類經(jīng)成分的含量存在差異；蔡垠等[3]研究發(fā)現(xiàn)溫度和時(shí)間是影響淫羊藿中黃酮類成分含量的重要因素，因此不同廠家的炮制工藝不同必然會(huì)引起不同廠家炙淫羊藿飲片中5種黃酮類成分含量的差異。

表2 不同廠家炙朝鮮淫羊藿飲片中黃酮類成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of flavone in Epimedium koreanum nakai decoction pieces from different manufactories（n＝3）

炮制會(huì)改變淫羊藿中黃酮類化學(xué)組分的配比，使多糖苷（如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等）向低一級(jí)糖苷（如淫羊藿苷）轉(zhuǎn)化，而低一級(jí)糖苷的滲透系數(shù)比多糖苷滲透系數(shù)高，吸收比多糖苷好[4]。本課題構(gòu)建了炙朝鮮淫羊藿飲片的評(píng)價(jià)體系，以便科學(xué)合理地控制炙朝鮮淫羊藿飲片的質(zhì)量，為炙淫羊藿朝鮮飲片的生產(chǎn)、檢驗(yàn)、臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

本研究建立的RP-HPLC法，通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化[5]，可以同時(shí)測(cè)定不同極性的黃酮類成分，如極性較大的朝藿定A和極性較小的寶藿苷I；同時(shí)，對(duì)極性相似、母核一致、取代基稍有不同而難于分離的成分如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C仍可達(dá)到基線分離，方法簡(jiǎn)便、可靠。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：229.

[2]Hua-Feng Zhang，Tian-Shun Yang，Zuo-Zhou Li，et al.Simultaneous extraction of epimedin A，B，C and icariin from Herba Epimedii by ultrasonic technique[J].Ultrasonics Sonochemistry，2008，15（4）：376.

[3]蔡 垠，陳 彥，賈曉斌，等.受熱溫度和時(shí)間對(duì)淫羊藿中黃酮成分含量的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（22）：2441.

[4]Yan Chen，Yan-hong Zhao，Xiao-bin Jia，et al.Absorption mechanisms of prenylated flavonoids and effects of heat processing on their stability and intestinal[J].Pharmaceutical Research，2008，25（9）：2190.

[5]陳 彥，趙艷紅，賈曉斌，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定不同品種淫羊藿藥材中5種主要黃酮類成分的含量[J].中國(guó)藥房，2008，19（6）：431.