烏頭類中藥中藥效指標(biāo)成分的確定及含量測定Δ

劉永剛，劉倩，張宏桂，喬延江#（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京市 000；.華北煤炭醫(yī)學(xué)院，唐山市 06003）

含烏頭堿中藥為常用中藥，如《中國藥典》收載的川烏、附子等[1]，該類中藥中生物堿成分既是其活性成分，也是毒性成分。該類中藥大都以炮制入藥，其質(zhì)量優(yōu)劣直接影響療效和用藥安全。然而，由于標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏和儀器的限制，即使《中國藥典》通過限定烏頭堿的最低檢測量來控制該類中藥的質(zhì)量，并通過減少使用量的方法來控制其安全，但中毒事件仍屢有發(fā)生[2]?；诖?，筆者以附子為研究對象，針對《中國藥典》對烏頭類中藥飲片及制劑只設(shè)質(zhì)量控制的安全指標(biāo)而無藥效指標(biāo)，導(dǎo)致此類有毒中藥制劑安全減效的問題進(jìn)行了研究，在初步確定新烏頭次堿為藥效指標(biāo)成分的基礎(chǔ)上，提出用烏頭堿作為毒性指標(biāo)成分、新烏頭次堿作為藥效指標(biāo)成分，以雙指標(biāo)質(zhì)量控制方案來確保烏頭類中藥的安全、有效。由于烏頭堿作為毒性指標(biāo)成分的研究方法比較成熟，本試驗著重對如何確定新烏頭次堿為藥效指標(biāo)成分和新烏頭次堿的含量測定方法進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，包括在線真空脫氣機、二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；HP Chemstation RVA0.803色譜工作站（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純；附子購自四川江油，由北京中醫(yī)藥大學(xué)譚鈺元教授鑒定為真品；新烏頭次堿標(biāo)準(zhǔn)品（筆者自制，經(jīng)HPLC法測定含量＞98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥效指標(biāo)成分的確定

2.1.1 新烏頭次堿的鑒定 通過質(zhì)譜、紫外、1H-NMR和13C-NMR確定為新烏頭次堿，并用HPLC法測定其純度＞98%。

2.1.2 附子中生物堿的含量測定 用LC-MSn法對附子中生物堿成分進(jìn)行初步鑒定，并根據(jù)其離子強度大小初步判定新烏頭次堿在烏頭類生物堿中含量最高。

2.1.3 附子入血成分的鑒定 通過給家兔灌服附子后，用LC-MSn法檢測入血成分，發(fā)現(xiàn)新烏頭次堿為入血成分。

“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”項詳細(xì)內(nèi)容另文發(fā)表。

2.1.4 烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭次堿受熱穩(wěn)定曲線的變化 將4種生物堿在100℃下進(jìn)行加熱，用HPLC分析峰面積的變化。4種生物堿受熱穩(wěn)定曲線的變化見表1。

表1 4種生物堿受熱穩(wěn)定曲線的變化Tab 1 Stability curves of 4 kinds of alkaloids in heated condition

2.2 新烏頭次堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zobax XDB C1（8250 mm×2.1 mm，5 μm）；檢測波長：240 nm；流動相：0.01%氨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（） ；柱溫：25 ℃；流速：1 mL·min-1。色譜見圖1。

2.2.2 溶液的制備 （1）標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：精密稱取新烏頭次堿標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，加0.01%鹽酸-甲醇制成每1 mL含新烏頭堿0.51 mg的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。（2）供試品溶液：取樣品粉末（過20目篩）1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加10%氨水1 mL浸潤，再精密加入乙醚25 mL，超聲提取30 min，吸取上清液，殘渣用乙醚洗滌3次，每次5 mL，合并提取液與洗滌的乙醚液，50℃水浴揮干乙醚，用0.01%鹽酸-甲醇10 mL溶解，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液[3]。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.5、1、1.5、2 mL，分別置于10 mL量瓶中，用0.01%鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定。以峰面積積分值（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝304.5X－3.53（r＝0.9998）。結(jié)果表明，新烏頭次堿進(jìn)樣量在0.51～10.2 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，新烏頭次堿峰面積的RSD＝0.51%，表明方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別在0、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，測定。結(jié)果，新烏頭次堿峰面積的RSD＝1.35%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一附子藥材粉末6份，每份1.0 g，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分析測定。結(jié)果，新烏頭次堿平均含量的RSD＝1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取附子樣品6份（其新烏頭次堿的含量為0.354 mg·g-1），分別精密加入新烏頭次堿標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.2.8 檢測限的測定 按信噪比為3∶1計算，本試驗條件下新烏頭次堿的檢測限按進(jìn)樣量計為1.5 ng。

2.2.9 樣品含量測定 取3個批次的樣品，分別按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值按回歸方程計算含量，結(jié)果見表3。

表3 不同批次炮制附子中新烏頭次堿的含量（n＝3）Tab 3 Content of benzoylmesaconine in different bathes of processedA.carmichaeli（n＝3）

3 討論

本試驗通過化合物的含量測定及是否為入血成分、標(biāo)準(zhǔn)物穩(wěn)定性性質(zhì)研究，初步建立了確定烏頭類中藥中藥效指標(biāo)成分的方法，這為其它中藥如何選擇標(biāo)準(zhǔn)品提供了方法上的借鑒。

若按照《中國藥典》規(guī)定的方法操作，烏頭類生物堿含量過低、炮制過度甚或烏頭類中藥偽品或贗品均較容易通過質(zhì)檢并作為藥用，這務(wù)必會降低成藥的療效。因此，增加新烏頭次堿含量控制項是合理、有效的，可用于加強烏頭類中藥的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：132.

[2]陳 幸，夏文娟，方娜娜.對《中國藥典》附子中烏頭堿限量檢查的商榷[J].藥物分析雜志，1995，15（4）：6.

[3]劉 芳，于向紅，李 飛.HPLC測定附子及其炮制品中3種雙酯型生物堿的含量[J].中國中藥雜志，2006，31（14）：1160.