關(guān)龍膽乙醇提取物在急性肺損傷中的作用研究

馬忠偉,王秋玲，魏培玉（山東昌邑市人民醫(yī)院，昌邑市 261300）

急性肺損傷（ALI）是以肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞廣泛損傷為病理特征的一種嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[1]。該病具有起病急、死亡率高的特點(diǎn)，流行病學(xué)調(diào)查顯示其病死率達(dá)35%～40%，是重癥監(jiān)護(hù)室病患死亡的主要原因之一[2]。ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中過度失調(diào)的炎性反應(yīng)被認(rèn)為是最重要的因素之一，炎性介質(zhì)與抗炎因子間的平衡決定了ALI的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。

關(guān)龍膽是龍膽科多年生草本植物，包括龍膽（Gentiana scabra B.）、三花龍膽（Gentiana triflora P.）及條葉龍膽（Gentiana manshurica K.），主產(chǎn)于我國東北和內(nèi)蒙古。其味苦、性寒，具有瀉肝實(shí)火、清下焦?jié)駸岬墓π?，主治黃疸、膽囊炎、高血壓、耳鳴等癥[3]。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)龍膽乙醇提取物能顯著抑制二甲苯和巴豆油引起的小鼠耳廓腫脹，減少冰醋酸致小鼠扭體次數(shù)[4]，提示關(guān)龍膽乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗炎作用。關(guān)龍膽乙醇提取物能否有效改善ALI中的炎癥反應(yīng)，目前尚未見相關(guān)報道。本研究擬采用ALI小鼠模型，初步探討關(guān)龍膽乙醇提取物在ALI炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料

1.1 儀器

R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；DZF系列真空干燥箱（上海華連醫(yī)療器械有限公司）；3K30型超低溫離心機(jī)（德國Sigma公司）；550型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

關(guān)龍膽（產(chǎn)地吉林，經(jīng)山東昌邑市人民醫(yī)院中藥房鑒定為真品）；醋酸地塞米松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：0905016）；脂多糖（LPS，美國 Sigma公司）；前列腺素 E2（PGE2）、白介素-10（IL-10）酶聯(lián)免疫法（ELISA）試劑盒（美國Cayman公司）；環(huán)氧化酶-2（COX-2）ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 動物

Ⅰ級純種NIH小鼠，♂，體質(zhì)量24～28 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物合格證號：SCXK20020001）。

2 方法

2.1 關(guān)龍膽乙醇提取物的制備

稱取關(guān)龍膽700 g，切碎，用95%乙醇回流浸提3次（分別為3、2、2 h），合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得浸膏，備用。

2.2 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為6組，即空白（等量生理鹽水）、模型（等量生理鹽水）、醋酸地塞米松（0.005 g·kg-1）及關(guān)龍膽乙醇提取物高、中、低劑量（10、5、2.5 g·kg-1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)5 d。。

2.3 ALI模型的復(fù)制[5，6]

ip 3%水合氯醛（0.3 g·kg-1）麻醉小鼠，頸部正中切口5 mm，分離氣管，微量注射器由氣管向肺方向滴注LPS溶液（2.5 mg·kg-1），1 min內(nèi)滴注完畢，消毒縫合切口，小鼠保溫護(hù)理。

2.4 ELISA法檢測PGE2、IL-10、COX-2

ALI模型復(fù)制24 h后處死小鼠，眼球取血，l 500 r·min-1離心10 min，保留血漿于－80℃貯藏。按照ELISA試劑盒說明書測定血漿PGE2、IL-10、COX-2水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠PGE2的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿PGE2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，關(guān)龍膽乙醇提取物高、中、低劑量組小鼠血漿PGE2水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿PGE2的影響見表1。

表1 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿PGE2的影響（，n＝8）Tab 1 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on PGE2 in mic（e，n＝8）

表1 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿PGE2的影響（，n＝8）Tab 1 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on PGE2 in mic（e，n＝8）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組醋酸地塞米松組關(guān)龍膽乙醇提取物低劑量組關(guān)龍膽乙醇提取物中劑量組關(guān)龍膽乙醇提取物高劑量組PGE2/pg·mL-1 744.24±21.301468.89±71.82＊1016.67±43.61#1158.92±39.08#1099.83±33.53#959.02±37.18##劑量/g·kg-1--0.0052.5510

3.2 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠IL-10的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿IL-10水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，關(guān)龍膽乙醇提取物高、中、低劑量組小鼠血漿IL-10水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿IL-10的影響見表2。

表2 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿IL-10的影響（，n＝8）Tab 2 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on IL-10 in mic（e，n＝8）

表2 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿IL-10的影響（，n＝8）Tab 2 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on IL-10 in mic（e，n＝8）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

IL-10/pg·mL-1 30.19±1.1799.35±8.98＊47.67±4.05#181.25±10.82#212.01±10.42#219.11±14.25##組別空白組模型組醋酸地塞米松組關(guān)龍膽乙醇提取物低劑量組關(guān)龍膽乙醇提取物中劑量組關(guān)龍膽乙醇提取物高劑量組劑量/g·kg-1--0.0052.5510

3.3 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠COX-2的影響

與空白組比較，模型組小鼠血漿COX-2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，關(guān)龍膽乙醇提取物高、中、低劑量組小鼠血漿COX-2水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿COX-2的影響見表3。

4 討論

ALI是由心源性以外的多種致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，多由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等原因引起，其病理表現(xiàn)以肺部炎性細(xì)胞、炎性介質(zhì)浸潤和毛細(xì)血管通透性增加為主。LPS是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是細(xì)菌內(nèi)毒素的重要成分，也是導(dǎo)致ALI的常見因素。

表3 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿COX-2的影響（，n＝8）Tab 3 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on COX-2 in mic（e，n＝8）

表3 關(guān)龍膽乙醇提取物對模型小鼠血漿COX-2的影響（，n＝8）Tab 3 Effect of ethanol extract of Radix et Rhizoma Gentianae on COX-2 in mic（e，n＝8）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組醋酸地塞米松組關(guān)龍膽乙醇提取物低劑量組關(guān)龍膽乙醇提取物中劑量組關(guān)龍膽乙醇提取物高劑量組COX-2/ng·mL-1 0.75±0.073.25±0.42＊1.77±0.65#2.11±0.29#1.62±0.31#1.27±0.28##劑量/g·kg-1--0.0052.5510

PGE2主要由COX催化花生四烯酸代謝生成，具有較強(qiáng)的擴(kuò)張血管、增加血管壁通透性、促進(jìn)炎性滲出的作用，是介導(dǎo)局部炎癥應(yīng)答的主要介質(zhì)之一，炎癥的發(fā)展與局部PGE2含量關(guān)系密切。COX-2為COX誘導(dǎo)型同工酶，易被各種因素誘導(dǎo)，是催化花生四烯酸生成PGE2的限速酶，其表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)中PGE2含量密切相關(guān)?？寡滓蜃覫L-10主要是由單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞產(chǎn)生，具有降低肺泡-毛細(xì)血管膜通透性、減少肺內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集的作用[7]。此外，研究表明IL-10對抗炎反應(yīng)具有雙重調(diào)節(jié)作用：IL-10可抑制炎性介質(zhì)IL-6和TNF-α，同時上調(diào)IL-1受體拮抗劑、可溶性腫瘤壞死因子受體等抗炎介質(zhì)，使體內(nèi)炎性介質(zhì)/抗炎介質(zhì)趨于平衡[8]。臨床資料也證實(shí)，ALI病死率與 IL-10 呈負(fù)相關(guān)[9]。PGE2、COX-2 和IL-10的變化可以反映機(jī)體內(nèi)急性炎癥反應(yīng)與抗炎介質(zhì)的變化。因此，本研究測定了這些指標(biāo)，用以評估關(guān)龍膽乙醇提取物在ALI炎癥反應(yīng)中的作用。

研究結(jié)果表明，LPS氣管灌注可誘導(dǎo)COX-2表達(dá)增加，加速PGE2生成，促進(jìn)ALI中炎癥的發(fā)展。關(guān)龍膽乙醇提取物可有效抑制COX-2的表達(dá)，減少PGE2生成，其效能與地塞米松相似。關(guān)龍膽乙醇提取物和地塞米松對血漿IL-10的作用則完全不同：關(guān)龍膽組血漿IL-10顯著高于模型組，地塞米松組則顯著低于模型組。這提示地塞米松作為一種免疫抑制劑在抑制促炎介質(zhì)生成、發(fā)揮抗炎作用的同時，也抑制了合成抗炎介質(zhì)的信號通路，在一定程度上對炎癥的繼續(xù)發(fā)展起到了推動作用。關(guān)龍膽乙醇提取物在有效抑制促炎介質(zhì)生成的同時，對抗炎介質(zhì)不僅無抑制作用，而且可誘導(dǎo)其大量生成，有利于損傷修復(fù)。

本研究通過動物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，關(guān)龍膽乙醇提取物可能通過誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生、抑制COX-2表達(dá)，進(jìn)而抑制PGE2的生成等機(jī)制在脂多糖致ALI中發(fā)揮抗炎作用，這可望為ALI提供新的治療藥物。

[1]Martin TR，Nakamura M，Matute-Bello G.The role of apoptosis in acute lung injury[J].Crit Care Med，2003，31（4Supp1）：184.

[2]Rubenfeld GD，Herridge MS.Epidemiology and outcomes of acute lung injury[J].Chest，2007，131：554.

[3]楊書彬，王 承.龍膽化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2005，33（6）：54.

[4]樸惠順，張紅英.關(guān)龍膽乙醇提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30（11）：1562.

[5]裴凌鵬.蝦青素對脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29（8）：937.

[6]章 卓，萬敬員，羅福玲，等.積雪草苷對脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷影響研究[J].中草藥，2008，39（8）：1196.

[7]Lnoue G.Effect of interleukin-10（IL-10）on experimental LPS-induced acute lung injury[J].J Infect Chemother，2000，6（1）：51.

[8]Barsness KA，Bensard DD，Patrick DA，et a1.IL-1beta induces an exaggerated pro-and anti-inflammatory response in peritoneal macrophages of children compared with adults[J].Pediatric Surgery International，2004，20（4）：238.

[9]熊旭明，江慧琳，劉炳煩，等.白細(xì)胞介素-10對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠炎癥因子的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2005，14（5）：380.