沙利度胺對(duì)伊立替康及其代謝物SN-38在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響Δ

史愛欣，胡艷玲，胡 欣

（衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學(xué)部，北京市 100730）

伊立替康（CPT-11）為選擇性拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌復(fù)發(fā)和惡化，也可單用或與其它藥物聯(lián)合用于小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌等其他腫瘤的治療。遲發(fā)型腹瀉是影響伊立替康應(yīng)用的最重要的不良反應(yīng)之一，伊立替康的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物SN-38的濃度與伊立替康引起的遲發(fā)型腹瀉有很大相關(guān)性[1～3]，一般認(rèn)為SN-38可引起腸道黏膜損害，導(dǎo)致腸道內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，向腸腔分泌水和電解質(zhì)過多而引發(fā)遲發(fā)型腹瀉。因此，控制SN-38的濃度成為減輕腸毒性的新研究方向。沙利度胺具有抗血管形成、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用，小規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)沙利度胺可以減輕伊立替康的腸毒性[4，5]。本研究以SD♂大鼠為受試對(duì)象，考察伊立替康聯(lián)用沙利度胺后對(duì)伊立替康及SN-38體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，為臨床減輕伊立替康的腸毒性及促進(jìn)其合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 試藥

伊立替康對(duì)照品（批號(hào)：160711012，純度：＞98%）、SN-38對(duì)照品（批號(hào)：20071024，純度：＞99%）均由江蘇恒瑞制藥公司提供；內(nèi)標(biāo)苯磺貝他斯汀對(duì)照品（天津田邊制藥有限公司提供，批號(hào)：06-02，純度：＞99.0%）；鹽酸伊立替康注射液（英國(guó)安萬特公司，商品名：開普拓，批號(hào)：D6D261，規(guī)格：100 mg·5 mL－1）；沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，批號(hào)：0710081，規(guī)格：每片25 mg）；乙腈、甲醇均為色譜純；乙酸、醋酸銨、甲酸、甲酸銨均為質(zhì)譜級(jí)；二甲亞砜為分析純；水為超純水。

1.2 儀器

2795型高效液相色譜系統(tǒng)、Quattro Premier串聯(lián)質(zhì)譜（MS）檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；D-37520 Biofuge高速離心機(jī)（德國(guó)Kendro公司）；LDZ5-2型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；AT201十萬分之一分析天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）。

1.3 動(dòng)物

SD♂大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2007-0001。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。

2 方法與結(jié)果

2.1 伊立替康及SN-38血藥濃度測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 建立LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中伊立替康及SN-38濃度的LC-MS條件，詳見文獻(xiàn)[6]。

2.1.2 溶液的制備。伊立替康對(duì)照品溶液：精密稱取伊立替康對(duì)照品適量，置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量甲醇使其完全溶解，用甲醇定容，即得200 μg·mL－1的伊立替康貯備液。

SN-38對(duì)照品溶液：精密稱取SN-38對(duì)照品適量，置于50 mL棕色容量瓶中，加入二甲基亞砜30 mL使其完全溶解，用甲醇定容，即得200 μg·mL－1的SN-38貯備液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取苯磺貝他斯汀對(duì)照品適量，置于100 mL棕色容量瓶中，滴加適量甲醇使其完全溶解，用純水定容，即得100 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)貯備液。以上所有溶液于4℃避光保存，并于臨用前取出放至室溫。

沙利度胺溶液：取適量沙利度胺片，置于研缽中研碎，混勻，精密稱取適量，置于50 mL容量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，震蕩搖勻，即得10 mg·mL－1的溶液，靜置。

2.1.3 方法專屬性。采用固相萃取方法進(jìn)行樣品預(yù)處理。在本試驗(yàn)條件下，血漿樣品中藥物與基質(zhì)中的其它組分得到良好分離，不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾?？瞻籽獫{、空白血漿+伊立替康（1000 ng·mL－1）+SN-38（50 ng·mL－1）+內(nèi)標(biāo)和大鼠尾靜脈注射伊立替康（10 mg·kg－1）及沙利度胺+伊立替康（10 mg·kg－1）4 h后血漿樣品的LC-MS/MS圖見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)及過程有效率、樣品稀釋誤差考察[6]。血漿中伊立替康和SN-38的線性回歸方程（Y：樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，C：樣品濃度）分別為Y＝0.4540C+0.1972（r＝0.9996）；Y＝0.0030C+0.0011（r＝0.9999）。伊立替康及SN-38線性范圍分別為1～2000、0.5～100 ng·mL－1，定量下限分別為1、0.5 ng·mL－1。批內(nèi)精密度分別為4.6%～6.4%、3.5%～4.9%，批間精密度分別為5.9%～6.7%、5.8%～8.1%；相對(duì)回收率分別為（96.09±2.96）%～（100.57±4.54）%、（98.04±3.43）%～（100.84±4.35）%。伊立替康及SN-38血漿處理后在4℃樣品室中至少能穩(wěn)定放置24 h，RSD分別為4.11%、4.62%；在室溫環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置1.5 h，RSD分別為2.83%、3.29%；在－70℃冰凍環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置30 d，RSD分別為2.66%、2.47%；在反復(fù)凍融3次后仍保持穩(wěn)定，RSD分別為2.35%和3.53%。伊立替康、SN-38和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均接近100%，RSD分別＜1.6%、＜4.7%、＜2.5%。伊立替康稀釋5倍的準(zhǔn)確度與精密度分別為99.06%、2.25%，稀釋10倍后分別為99.00%、3.29%；SN-38稀釋5倍的準(zhǔn)確度與精密度分別為100.08%、0.75%，稀釋10倍后分別為99.83%、0.66%。表明樣品經(jīng)空白血漿稀釋后不影響測(cè)定準(zhǔn)確度和精密度。

2.2 給藥方法

實(shí)驗(yàn)分為伊立替康10、20 mg·kg－12個(gè)劑量組；每一劑量組均設(shè)1個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為伊立替康與沙利度胺聯(lián)用，對(duì)照組單用伊立替康。實(shí)驗(yàn)組先腹腔注射沙利度胺藥液20 mg·kg－1，0.5 h后尾靜脈注射伊立替康注射液；對(duì)照組先腹腔注射與沙利度胺藥液同體積的二甲亞砜，0.5 h后尾靜脈注射伊立替康注射液。于給藥前和給藥后0.083、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、12 h頸靜脈插管采血1 mL，置于肝素化抗凝試管中，3000 r·min－1離心5 min，分離血漿，于－70 ℃冰箱中保存待測(cè)。

2.3 血藥濃度數(shù)據(jù)結(jié)果

各組給藥后伊立替康、SN-38血藥濃度均值-時(shí)間曲線見圖2。

由圖2A可見，2個(gè)劑量的伊立替康與沙利度胺合用后伊立替康血藥濃度及AUC0～t均明顯高于單用伊立替康；由圖2B可見，伊立替康（10 mg·kg－1）劑量組與沙利度胺合用后與單用伊立替康組比較，SN-38血藥濃度-時(shí)間曲線變化不明顯，而伊立替康（20 mg·kg－1）劑量組與沙利度胺合用后SN-38血藥濃度、AUC0～t明顯低于單用伊立替康組。

圖1 LC-MS/MS圖Ⅰ-A、Ⅱ-A、Ⅲ-A.空白血漿；Ⅰ-B、Ⅱ-B、Ⅲ-B.空白血漿+伊立替康+SN-38+內(nèi)標(biāo)；Ⅰ-C、Ⅱ-C、Ⅲ-C.大鼠尾靜脈注射伊立替康后4 h血樣；Ⅰ-D、Ⅱ-D、Ⅲ-D.大鼠尾靜脈注射沙利度胺+伊立替康后4 h血樣；Ⅰ.伊立替康；Ⅱ.SN-38；Ⅲ.內(nèi)標(biāo)Fig 1 LC-MS/MS chromatogramsⅠ-A，Ⅱ-A，Ⅲ-A.blank plasma；Ⅰ-B，Ⅱ-B，Ⅲ-B.blank plasma+irinotecan+SN-38+internal standard；Ⅰ-C，Ⅱ-C，Ⅲ-C.blood sample of rats at 4 h after administration of irinotecan via tail vein；Ⅰ-D，Ⅱ-D，Ⅲ-D.blood sample of rats at 4 h after administration of thalidomide+irinotecan via tail vein；Ⅰ.irinotecan；Ⅱ.SN-38；Ⅲ.internal standard

2.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析結(jié)果

血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)DASver2.0軟件擬合計(jì)算，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1及表2。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0軟件，對(duì)主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0～t、AUC0～∞、Cmax及t1/2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。

圖2 各組給藥后伊立替康、SN-38血藥濃度均值-時(shí)間曲線A.伊立替康；B.SN-38Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of irinotecan and SN-38 of those groups after medicationA.irinotecan；B.SN-38

表1 伊立替康10 mg·kg－1劑量給藥后伊立替康及SN-38的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of irinotecan and SN-38 in rats after administration of 10 mg·kg－1irinotecan

表2 伊立替康20 mg·kg－1劑量給藥后伊立替康及SN-38的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of irinotecan and SN-38 in rats after administration of 20 mg·kg－1irinotecan

表3 伊立替康及SN-38主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（P值）Tab 3 Analysis of main pharmacokinetic parameters of irinotecan and SN-38（P value）

由表1、表2、表3可知，聯(lián)用沙利度胺后，與單用伊立替康比較，伊立替康10 mg·kg－1劑量組中其 AUC0～t、AUC0～∞、Cmax顯著增加（P＜0.05），t1/2縮短，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；20 mg·kg－1劑量組中Cmax顯著增加（P＜0.05），AUC0～t及AUC0～∞雖有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)于SN-38，與對(duì)照組比較，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的AUC0～t、AUC0～∞均顯著減少（P＜0.05），20 mg·kg－1劑量實(shí)驗(yàn)組的Cmax顯著降低（P＜0.05），這說明沙利度胺可以增加伊立替康的AUC0～t同時(shí)減少SN-38的AUC0～t及Cmax。

3 討論

伊立替康為前體藥物，在體內(nèi)經(jīng)過羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物SN-38，后者活性較伊立替康強(qiáng)100～1000倍。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡醛酰轉(zhuǎn)移酶（UGT）滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）。SN-38G經(jīng)腸道細(xì)菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶作用轉(zhuǎn)化為SN-38，造成腸道黏膜損害，導(dǎo)致遲發(fā)型腹瀉的發(fā)生[1～3]。腸道內(nèi)SN-38可造成腸道結(jié)構(gòu)和功能的損害，造成腸道黏膜受損，引起腸道內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，導(dǎo)致向腸腔分泌水和電解質(zhì)過多而引發(fā)遲發(fā)型腹瀉。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠為對(duì)象，研究了聯(lián)用沙利度胺時(shí)伊立替康的藥動(dòng)學(xué)特征，擬合得到大鼠體內(nèi)伊立替康和SN-38的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。迄今為止國(guó)內(nèi)未見聯(lián)用沙利度胺對(duì)伊立替康的藥動(dòng)學(xué)影響的研究報(bào)道。

聯(lián)用沙利度胺后，在增加伊立替康的AUC0～t同時(shí)減少SN-38 的 AUC0～t及 Cmax，此結(jié)果與國(guó)外文獻(xiàn)結(jié)果相似[4，7]：國(guó)外文獻(xiàn)中，伊立替康合用沙利度胺后，其AUC0～t、AUC0～∞分別增加 32.50%、39.02%，同時(shí) SN-38 的 AUC0～t、AUC0～∞下降了24%、42%。說明沙利度胺與伊立替康合用后改變了伊立替康及其代謝物SN-38的藥動(dòng)學(xué)特征。

本研究結(jié)果從藥動(dòng)學(xué)方面解釋了沙利度胺能減輕伊立替康致遲發(fā)型腹瀉的作用機(jī)制，為進(jìn)一步減輕伊立替康的腸毒性及促進(jìn)其合理用藥提供參考和數(shù)據(jù)支持。

[1]Ahmed F，Vyas V，Cornfield A，et al.In vitro activation of irinotecan to SN-38 by human liver and intestine[J].Anticancer Res，1999，19（3A）：2067.

[2]Kehrer DF，Sparreboom A，Verweij J，et al.Modulation of irinotecan-induced diarrhea by cotreatment with neomycin in cancer patients[J].Clin Cancer Res，2001，7（5）：1136.

[3]Michael M，Brittain M，Nagai J，et al.PhaseⅡstudy of activated charcoal to prevent irinotecan induced diarrhea[J].J Clin Oncol，2004，22（21）：4410.

[4]Yang XX，Hu ZP，Xu AL，et al.A mechanistic study on reduced toxicity of irinotecan by coadministered thalidomide，a tumor necrosis factor-alpha inhibitor[J].J Pharmacol Exp Ther，2006 ，319（1）：82.

[5]Rangaswamy Govindarajan，Keith M Heaton，Ralph Broadwater，et al.Effect of thalidomide on gastrointestinal toxic effects of irinotecan[J].Lancet，2000，356（9229）：566.

[6]史愛欣，胡艷玲，胡 欣.LC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中伊立替康及代謝物SN-38的濃度[J].藥物分析雜志，2010，30（1）：71.

[7]Yang XX，Hu ZP，Chan SY，et al.Pharmacokinetic mechanisms for reduced toxicity of irinotecan by coadministered thalidomide[J].Curr Drug Metab，2006，7（4）：431.