琥珀酸亞鐵片3種含量測定方法的比較Δ

孫祥德，董 麗，席榮英

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新鄉(xiāng)市 453003）

琥珀酸亞鐵片是補(bǔ)鐵的常用制劑，其主要成分為琥珀酸亞鐵。目前，該制劑尚未被《中國藥典》收載，地方標(biāo)準(zhǔn)是用氧化還原滴定法（硫酸鈰法）測定含量。文獻(xiàn)報道[1～5]不少其它的補(bǔ)鐵制劑常用分光光度法，但尚未見分光光度法和高效液相色譜（HPLC）法測定琥珀酸亞鐵片含量的報道。容量分析、光譜分析和色譜分析是藥物制劑最主要的含量測定方法，雖然滴定分析法操作簡便、準(zhǔn)確度較高，但與光譜法和色譜法相比，其專屬性較差，測定結(jié)果易受制劑中附加劑的干擾。為此，本文建立了分光光度法和HPLC法測定琥珀酸亞鐵片含量的2種新方法，并將2種方法的測定結(jié)果與硫酸鈰法進(jìn)行比較分析，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供更全面、簡便、快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料

1.1 儀器

LC-6AD HPLC儀、SPD-20A紫外檢測器（日本Shimadzu公司）；XK96-A快速混合器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；pHS-3C精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；T6紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試藥

磷酸二氫鉀、磷酸、硫酸亞鐵銨、硫酸鈰、醋酸銨、醋酸、鄰二氮菲、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA）均為國產(chǎn)分析純試劑；琥珀酸對照品（系用國產(chǎn)分析純琥珀酸試劑在乙醇中重結(jié)晶提純制得，純度：＞99.8%）；琥珀酸亞鐵片（金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號：070302、070310、070512，規(guī)格：每片0.1 g，含量：含鐵（Fe2+）34.0%～36.0%）；試驗(yàn)用水為自制二次蒸餾水。

1.3 試液制備

0.1 mol·L－1硫酸鈰標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取硫酸鈰約42 g，加入含有28 mL硫酸的水500 mL，加熱溶解后，放冷，加水適量使成1000 mL，搖勻。用基準(zhǔn)三氧化二砷標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。

鄰二氮菲指示液：取硫酸亞鐵0.5 g，加水100 mL使溶解，加2滴硫酸與0.5 g鄰二氮菲，搖勻即得。本液應(yīng)在使用時新鮮制備。

Fe2+對照品溶液：稱取硫酸亞鐵銨0.1486 g，置于250 mL棕色容量瓶中，加水溶解后，加鹽酸（1→2）0.30 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。臨用前，準(zhǔn)確量取貯備液2.50 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL相當(dāng)于0.004244 mg的Fe2+）。

鄰二氮菲溶液（1.2 g·L－1）：取鄰二氮菲60 mg，加50 mL水溶解，即得。

pH 4.20緩沖液：稱取乙酸銨125 g溶解于約75 mL蒸餾水中，用冰乙酸調(diào)pH值為4.20，再用水稀釋至500 mL，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫酸鈰法

取本品20片，除去薄膜衣后精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于琥珀酸亞鐵0.5 g），加稀硫酸20 mL和水30 mL的混合液，振搖使琥珀酸亞鐵溶解后，加鄰二氮菲指示液2滴，立即用硫酸鈰滴定液滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL硫酸鈰滴定液（0.1 mol·L－1）相當(dāng)于5.585 mg的Fe2+。

2.2 分光光度法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。移取Fe2+對照品溶液0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mL置于一系列50 mL容量瓶中，各加入鄰二氮菲溶液2 mL，緩沖液10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。5 min后，在分光光度計(jì)510 nm波長處，以試劑空白作參比，測定吸光度。以濃度（C）對吸光度（A）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝5.4142A－0.00266（r＝0.9998），F(xiàn)e2+的檢測濃度線性范圍為0.04244～2.546 mg·L－1。

2.2.2 精密度試驗(yàn)。制備2.546、0.8488、0.04244 mg·L－13個濃度的對照品溶液，各溶液于同日內(nèi)重復(fù)測定吸光度5次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算Fe2+濃度及日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD均小于1.0%，日間RSD均小于1.90%。

2.2.3 方法回收率試驗(yàn)。取“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液，準(zhǔn)確加入適量的Fe2+對照品溶液，測定Fe2+，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為99.5%。

2.2.4 Fe2+含量測定。取本品20片，除去薄膜衣后精密稱定，研細(xì)，精密稱取約半片質(zhì)量的樣品粉末置于50 mL容量瓶中，加水適量，超聲溶解20 min，過濾。準(zhǔn)確量取續(xù)濾液2.0 mL至50 mL容量瓶中加水至刻度，得供試品溶液。取供試品溶液10.00 mL于50 mL容量瓶中，加入3%EDTA溶液5 mL，鄰二氮菲溶液2 mL，緩沖溶液10 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。5 min后，在分光光度計(jì)510 nm波長處，以試劑空白作參比，測定吸光度。供試品、對照品及不含琥珀酸亞鐵的空白輔料溶液的吸收光譜曲線見圖1。

圖1 紫外吸收光譜1.對照品；2.供試品；3.空白輔料Fig 1 UV absorption spectrum1.reference；2.sample；3.blank excipients

2.3 HPLC法

2.3.1 色譜條件。色譜柱：大連依利特Sinochrom ODS-BP（200 mm×4.6 mm，5 μm）；預(yù)柱：C18（25 mm×4.6 mm）；流動相：0.05 mol·L－1KH2PO4（pH＝2.50）；檢測波長：215 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密稱定琥珀酸對照品適量，加流動相溶解，制備成濃度為32.2 mmol·L－1的琥珀酸對照品溶液，用流動相依次等體積稀釋，得到一系列濃度不等的對照溶液。分別取上述系列對照液20μL進(jìn)樣。以濃度（C）對相應(yīng)的峰面積（A）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C＝1.5145×10－5A+0.1706（r＝0.9990），琥珀酸檢測濃度線性范圍為0.25～32.2 mmol·L－1。

2.3.3 精密度試驗(yàn)。制備32.2、4.00、0.25 mmol·L－13 個濃度的對照品溶液，各溶液同日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD均小于1.5%，日間RSD均小于2.1%。

2.3.4 方法回收率試驗(yàn)。取“2.3.5”項(xiàng)下供試品溶液，準(zhǔn)確加入適量的琥珀酸對照品溶液，測定加樣回收率，結(jié)果平均回收率為99.8%。

2.3.5 樣品含量測定。取本品20片，除去薄膜衣后精密稱定，研細(xì)，精密稱取約2片質(zhì)量的樣品粉末于100 mL容量瓶中，加適量流動相，超聲20 min，用流動相稀釋至刻度，0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液，進(jìn)樣20μL。將測定的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算。

在上述色譜條件下得到的琥珀酸對照品溶液和供試品溶液的色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；1.琥珀酸Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference；B.sample；1.succinic acid

2.4 3種方法含量測定結(jié)果

3種方法測定每片琥珀酸亞鐵片中Fe2+含量的結(jié)果見表1。

將本文建立的分光光度法測定結(jié)果與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法硫酸鈰法測定結(jié)果在95%置信水平上進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，結(jié)果表明2種方法的精密度和測定結(jié)果之間均無顯著性差異。

3 討論

鄰二氮菲光度法是測定Fe2+濃度的常用方法，已有很多文獻(xiàn)[1～5]報道以其測定不同類型樣品中的Fe2+含量。其測定原理是在適宜的pH值條件下，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲生成1∶3橙紅色的穩(wěn)定配合物，該配合物在510 nm波長處有最大吸收。本試驗(yàn)通過優(yōu)化顯色劑用量、顯色時間、顯色溶液pH值等條件，建立了鄰二氮菲光度法測定琥珀酸亞鐵片中Fe2+含量的測定方法。亞鐵鄰二氮菲配合物在較廣泛的pH值范圍內(nèi)（pH2～9）都能穩(wěn)定存在，但由于Fe2+在堿性介質(zhì)中易被空氣中的氧氧化為Fe3+，再者Fe2+在堿性較強(qiáng)的溶液中與OH－之間具有較強(qiáng)的配位副反應(yīng)，而在微酸性介質(zhì)中較為穩(wěn)定，因此本試驗(yàn)選擇在酸性介質(zhì)中進(jìn)行顯色。結(jié)果表明，顯色反應(yīng)在pH 4.20的緩沖溶液中顯色完全，配合物穩(wěn)定性好。在上述顯色條件下，配合物溶液的吸光度在顯色5 min時達(dá)到最大且穩(wěn)定。在測定Fe2+含量時，選用EDTA為掩蔽劑，可以有效地掩蔽Fe3+和其它高價金屬離子對Fe2+測定的干擾。

表1 3種方法測定琥珀酸亞鐵片中Fe2+含量的結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of content determination of three kinds of methods（n＝3）

HPLC測定的原理是基于琥珀酸中的羧基在215 nm波長處有紫外吸收而能被檢測。琥珀酸亞鐵中琥珀酸根離子與Fe2+的摩爾比為1∶1，通過測定琥珀酸根離子的量即可計(jì)算Fe2+的含量。固定甲醇比例調(diào)整不同pH值0.05 mol·L－1KH2PO4溶液，以及固定0.05 mol·L－1KH2PO4溶液pH值調(diào)整甲醇比例，從而選擇合適的流動相。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)流動相中緩沖液的pH值大于2.80時，或者含有一定比例的甲醇時，琥珀酸都會出現(xiàn)多峰，或搭肩峰、峰前延、拖尾峰等，這可能是因?yàn)殓晁釣槎?，在溶液中因解離而以多種型體存在，各種存在型體的比例決定于溶液的pH值，因此，控制溶液的pH值以抑制其解離，是得到良好色譜峰的重要條件。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)使用0.05 mol·L－1KH2PO4（pH＝2.5）溶液為流動相時，琥珀酸不僅以單峰出現(xiàn)，而且峰形良好。

琥珀酸亞鐵片是一種含鐵（Fe2+）34.0%～36.0%的無水堿式鹽，其主要活性成分為琥珀酸亞鐵。比較3種方法的測定結(jié)果可知，本文建立的鄰二氮菲光度法的測定結(jié)果，與硫酸鈰法的測定結(jié)果一致。2種方法測定琥珀酸亞鐵片中亞鐵含量的測定結(jié)果無顯著性差異，說明2種方法均可用于該片劑的質(zhì)量控制，但以光譜法的專屬性較好，操作簡便快速。因此，本文建立的鄰二氮菲光度法可以替代現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的硫酸鈰法，用于琥珀酸亞鐵片的含量測定。

HPLC法的測定結(jié)果明顯小于其他2種方法（大約為其80%），這是因?yàn)殓晁醽嗚F片是一種含鐵（Fe2+）的無水堿式鹽，無確定的結(jié)構(gòu)式和分子式，除了琥珀酸亞鐵外，亞鐵還有其他的存在形式，而HPLC是通過測定琥珀酸根離子來測定Fe2+的，所以，該法測定結(jié)果小于其他2種方法。因此，HPLC方法只能測定與琥珀酸根結(jié)合的亞鐵，不能用于測定總的亞鐵含量。琥珀酸亞鐵為有機(jī)鐵劑，具有不損傷胃黏膜、胃腸道反應(yīng)較輕的特點(diǎn)[6]。本品在胃酸中解離出的琥珀酸能參與三羧酸循環(huán)和血紅蛋白合成，而且可以促進(jìn)亞鐵離子的吸收[7]，是各種亞鐵鹽中吸收率較好者[8～10]。由此可見，琥珀酸亞鐵是該制劑的主要的有效成分，利用HPLC測定其有效成分，對控制琥珀酸亞鐵的生產(chǎn)工藝，確保其主要成分的含量，有著一定的應(yīng)用價值。

總之，在本文所建立的2種新方法中，鄰二氮菲光度法簡便、快速、準(zhǔn)確，可以替代硫酸鈰法用于琥珀酸亞鐵片的含量測定；而HPLC法雖不能測定總的亞鐵含量，但可以測定其有效成分琥珀酸亞鐵的含量，對優(yōu)化生產(chǎn)工藝和全面控制本制劑質(zhì)量具有一定的意義。

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