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    均勻設計法優(yōu)化抗暈動中藥處方

    2010-05-22 03:07:38許景峰王金萍趙維娟北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科北京市100700
    中國藥房 2010年7期
    關鍵詞:木香處方小鼠

    陳 艷,許景峰,王金萍,曾 明,趙維娟(北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科,北京市 100700)

    暈動病又稱運動病,是指機體暴露于被動運動環(huán)境中,由于定向功能和平衡功能失調引起的的一系列植物神經(jīng)功能亢進的應激反應[1],表現(xiàn)為眩暈、惡心、嘔吐等。目前,暈動病的治療主要通過西藥抑制嘔吐中樞,這些藥物的局限性是具有明顯的自主神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用,大多有鎮(zhèn)靜作用。中藥抗暈動病療效確切,用藥安全,因此抗暈動中藥的研究具有特殊意義。

    Michell[2]認為,大鼠無嘔吐反射,在遭受前庭刺激后出現(xiàn)異嗜行為,相當于其它動物的嘔吐癥狀。于旭紅等[3]經(jīng)過大量實驗發(fā)現(xiàn)并驗證了一種抗暈動病藥物篩選和評價的新方法——暈反應指數(shù)評價法。本研究通過預試驗初步篩選出了3味抗暈動中藥:生姜、藿香和木香。為了證明其抗暈動效果,并進一步確定達最大抗暈動藥效三者間的最佳配比,筆者采用均勻設計安排各試驗點,以小鼠旋轉刺激誘發(fā)暈動病,以暈反應指數(shù)為評價指標進行處方優(yōu)化。

    1 材料

    1.1 儀器

    Agilent 1050 series高效液相色譜(HPLC)儀,包括Agilent 1050四元泵、G79853A紫外檢測器、Agilent 1050色譜工作站(美國惠普公司);純水系統(tǒng)(美國HiTech公司);JA2003 M型電子天平(上海天平儀器廠);WTD500A型可控性三臂式旋轉儀、塑料掛籃(高30 cm、直徑15 cm)由第二軍醫(yī)大學藥理教研室自制。

    1.2 試藥

    生姜(山東安丘白芬子鎮(zhèn))、廣藿香(江西吉水縣水南藥用百草油提煉廠)、木香(本院中藥房領?。┙?jīng)筆者薄層及氣相鑒別為真品;6-姜酚標準品(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司,批號:6-JF-070711,經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、IR、UV、MS鑒定為6-姜酚,經(jīng)HPLC法檢查純度>98%);木香烴內酯(CT)、去氫木香內酯(DL)對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號分別為111524-200503、111525-200706);茶苯海明(北京益民藥業(yè)有限公司,批號:080512);吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)。

    1.3 動物

    清潔級昆明種小鼠,♀♂各半,體質量(18~22)g,由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供(實驗動物質量合格證號:SCXK(滬)2007-0003)。小鼠隨機分為處方1組、處方2組、處方3組、處方4組、處方5組、茶苯海明組和空白對照組,每組10只,♀♂各半。

    2 方法與結果

    2.1 藥材的提取與檢測

    2.1.1 姜油的萃?。喝∩r品,切片,自然晾干,按2005年版《中國藥典》[4]精密稱取適量進行超臨界CO2(SFE-CO2)萃取得姜油。優(yōu)化后的萃取工藝為:萃取溫度45℃,萃取壓力30 MPa,二級高壓萃取釜萃取浸泡時間2.5 h,流體取樣量約5 mL,取樣過程氣體流速0.3~0.9 L·min-1。用HPLC法測得提取物中6-姜酚的含量為19.023%,表明提取物質量較好。

    2.1.2 廣藿香揮發(fā)油的提取:以莖葉比2∶8取廣藿香藥材,粉碎,過2號篩(24目),混合均勻,精密稱取藥材碎末,置揮發(fā)油提取器的2000 mL硬質圓底燒瓶中,加水800 mL,加入幾粒沸石,充分振搖混勻后加塞密閉浸泡2 h,接通冷凝水,緩緩加熱燒瓶至微沸并保持微沸,調節(jié)冷凝水的大小使餾出液的溫度低于40℃,直至揮發(fā)油的體積不再增加,停止加熱,收集油層部分。照2005年版《中國藥典》的氣相色譜法[6]對提取物進行含量測定。本品含百秋李醇為26.12%,符合規(guī)定。

    2.1.3 木香的提?。簩⒛鞠闼幉姆鬯?,精密稱取適量,按正交試驗優(yōu)化的最佳工藝進行回流提?。?0倍量80%乙醇,回流提取3次,每次1 h。本研究采用水浴回流,溫度控制在84℃左右。用紗布粗濾后再用濾紙過濾,收集樣品提取液于旋轉蒸發(fā)儀上減壓回收乙醇,并將提取液進行濃縮。采用HPLC法進行測定[5],每1 g木香藥材提取木香烴內酯13.485 mg、去氫木香內酯16.252 mg。

    2.2 均勻設計方法

    2.2.1 因素水平:大量文獻的調查及預試驗結果初步確定3個考察因素及其水平的基本范圍為:生姜0~80 g,藿香0~60 g,木香0~10 g,水平數(shù)≥5。因素水平見表1。

    表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

    2.2.2 均勻設計試驗結果:由于因素為3,m/2+1=3,m=4(m為最多可安排的列數(shù)),n=m+1=5(n為行數(shù)),故選取均勻分布表U5(54)。由于本研究只有3因素,則從相應的使用表中查得因素為3時對應的列號是1、2、4列,因此組成5行3列的U5(53)表,其中1~5組為試驗組,第6組為使用茶苯海明作對照藥的陽性對照組,第7組為空白對照組。均勻設計試驗結果見表2。

    表2 均勻設計試驗結果Tab 2 Results of optimizing experiment

    2.3 藥效學實驗

    2.3.1 刺激量的設定:旋轉器為可控性三臂式旋轉儀,三臂的臂長均為28 cm,每臂掛3只掛籃,每只掛籃放動物1只。實驗時小鼠無束縛地放入旋轉器塑料掛籃內,繞垂直軸水平旋轉。處方1~5組及茶海拉明組、空白對照組給予的刺激量均為:以80次·min-1順時針方向旋轉1 min,然后逆時針方向旋轉1 min,如此反復持續(xù)刺激動物90 min致暈。

    2.3.2 給藥量:分別以表2中實驗1~5組中各藥材的量,按每20 g小鼠體質量給予劑量的0.0026倍量進行ig給藥,生姜、藿香和木香的劑量分別按提取率折算成提取產(chǎn)物(以2%吐溫-80溶液配制,每20 g小鼠體質量的給藥體積為0.3 mL);茶苯海明組:每20 g小鼠體質量給予0.13 mg茶苯海明(以2%吐溫-80溶液溶解藥物,每20 g小鼠體質量的給藥體積為0.3 mL);空白對照組:ig等量2%吐溫-80溶液。

    2.3.3 評價指標:♀♂小鼠分別飼養(yǎng)在代謝籠內,可自由飲水和進食,適應性飼養(yǎng)3 d,每次于實驗開始的前一天晚上12∶00左右給小鼠禁食,可自由飲水,第二天早上8∶00左右開始實驗。取同性別小鼠各組1只分別按上述劑量進行ig給藥,給藥后30 min以上述旋轉刺激方式和時間進行旋轉刺激,刺激結束后將動物置于地面,立即觀察動物的反應。所有的反應均在旋轉結束后2 min內產(chǎn)生,計算出暈反應指數(shù)。評分標準見表3。

    表3 評分標準Tab 3 Scoring criteria

    2.3.4 結果:受刺激前小鼠皮毛光滑,反應靈敏。隨著刺激時間的延長,小鼠全身毛皮聳立蓬松,排便、尿次數(shù)明顯增多,活動明顯減少,部分小鼠出現(xiàn)顫抖、煩躁不安、多動、咀嚼等現(xiàn)象。刺激停止后60 min逐漸恢復。

    由于實驗5 d每天的天氣晴陰、環(huán)境因素不同均會影響小鼠的暈反應強度,為使數(shù)據(jù)具有可比性,1~5 d必須分天統(tǒng)計,每天以茶苯海明組的兩輪暈反應指數(shù)之和為100%,其它各組的兩輪暈反應指數(shù)之和除以當天茶苯海明組兩輪暈反應指數(shù)之和作為暈動率,以5 d暈動率之和為統(tǒng)計量,旨在減少實驗誤差。暈反應指數(shù)測定結果見表4。

    3 討論

    表4 暈反應指數(shù)測定結果Tab 4 Results of MS index

    由于隨時間的推移動物的饑餓狀態(tài)和環(huán)境等發(fā)生變化,禁食至下午的小鼠暈反應不明顯,因此實驗分5個上午進行,每個上午進行兩輪,每輪分別取1~7組每組1只同性別小鼠進行實驗。

    利用Uniform Design Version 2.20均勻設計軟件采用全回歸法對表4中數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,得多元線性回歸模型無效,即線性不顯著。根據(jù)均勻設計的理論,可以利用均勻設計的試驗點布點均勻、代表性強的特性,用直接觀察法從所有試驗中挑選表現(xiàn)最好的試驗條件組合而結束試驗設計(不再進行數(shù)據(jù)的分析處理)。從表4中可以看出,處方1、2組的暈反應指數(shù)顯著低于茶苯海明組,說明處方1、2組的抗暈效果顯著強于茶苯海明藥,其中處方2組的暈反應指數(shù)最低,抗暈效果最好;處方3、5組的暈反應指數(shù)與茶苯海明組較接近,其中處方3的抗暈作用略強于茶苯海明,處方5略弱于茶苯海明;處方4組的暈反應指數(shù)顯著高于茶苯海明組,抗暈效果較差。

    采用SPSS統(tǒng)計軟件對表4中各組暈動率進行統(tǒng)計處理,2組間比較采用非配對t檢驗,多組間比較采用ANOVA方差分析。結果表明,處方1、2顯著優(yōu)于茶苯海明,處方4顯著弱于茶苯海明。因此,選定處方2(生姜60 g,藿香45 g,木香5 g)為最佳處方。

    [1]王爾貴,薛龍增,張炳新,等.暈動病的病因及防治[J].聽力學及言語疾病雜志,2002,10(4):276.

    [2]Michell D.Motion Sickness-induced pica in rats[J].Clin Nutr,1977,30:147.

    [3]于旭紅,蘇定馮.抗運動病新藥的研究:從新的動物模型到新的模型動物[D].第二軍醫(yī)大學碩士論文,2007.

    [4]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2005年版.北京:化學工業(yè)出版社,2005:30、66.

    [5]童榮生,孫世明,吳正中.反相高效液相色譜法測定理氣復胃口服液中木香烴內酯的含量[J].中國藥房,2006,17(3):211.

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