雙重RT-PCR方法檢測豬流感病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒

羅 俊，劉業(yè)兵，陳 堅，寧宜寶

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.北京信得威特科技有限公司，北京 100302；3.廣東永順生物制藥有限公司，廣東 廣州 511356)

豬流感(Swine influenza，SI)是由正粘病毒科SI病毒(SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。不同日齡、性別和品種的豬均可感染該病[1-2]。目前，已發(fā)現(xiàn)的A型SIV有H1N1、H3N2、H9N2等11種血清亞型，我國流行的血清亞型主要有人源H3N2、經典豬源H1N1和類禽源H1N1[3]。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病。臨床上以母豬妊娠后期的繁殖障礙，新生仔豬的呼吸癥狀和仔豬的高死亡率為特征[4]。

近年來，SIV和PRRSV在臨床上多為混合感染，并且臨床癥狀不典型，僅根據臨床癥狀確診比較困難。傳統(tǒng)的鑒別診斷方法是病原分離鑒定和血清學診斷，但所需時間較長，在混合感染診斷中存在不夠靈敏的情況。RT-PCR技術具有快速、敏感和易于操作的特點，被廣泛應用于畜禽傳染病的檢測和鑒別診斷[5]。多重RT-PCR技術是在RT-PCR基礎上發(fā)展起來的一種檢測技術，一次RT-PCR反應能同時檢測多種病原，具有簡便、快速的鑒別和檢測多種病原的優(yōu)點，能夠同時滿足多種疾病診斷的要求。為此，本研究進行了SIV和PRRSV的雙重RT-PCR檢測方法的研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細胞 H1N1和H3N2型SIV、禽流感(AIV)H9N2分離株、PRRSV VR-2332和BJ分離株、Marc-145細胞均由本實驗室保存；H5亞型AIV滅活抗原由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)由本研究所豬瘟參考實驗室提供；9日齡～10日齡SPF雞胚購自北京中海公司。

1.2 主要試劑 TRIzol、PfuUItraTMⅡFusion HS DNA Polymerase、SuperScriptTMⅢ Reverase和 Transcriptase均購自Invitrogen公司；pGEM-T購自Promega公司；TOP10菌株購自天根生化科技(北京)有限公司；總RNA提取試劑盒購自OMEGA公司。

1.3 引物設計 根據SIV亞型M基因保守序列設計SIV檢測引物，M-F：5'-TCAGGCCCCCTCAAA G-3'和 M-R： 5'-TATGAGGCCCATGCAACT-3'， 擴增片段為345 bp。根據PRRSV美洲型毒株N基因保守序列設計PRRSV檢測引物，P-F：5'-GTGGCA GAAAAGCTGTTAAG-3'和 P-R：5'-TTGAATAGGTG ACTTAGAGGC-3'，擴增片段為520 bp。引物由英濰捷基北京公司合成。

1.4 病毒培養(yǎng) 將PRRSV BJ株接種單層Marc-145細胞，37℃吸附1 h，加入含2%牛血清的DMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，75%細胞病變(CPE)時收毒，病毒含量為105.3TCID50/0.1 mL； H1N1亞型SIV接種9日齡～10日齡SPF雞胚尿囊腔，72 h收獲尿囊液，病毒含量為104.5EID50/0.1 mL。

1.5 RNA提取及反轉錄 按總RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA，并進行反轉錄。反應體系為：病毒總 RNA 10 μL，dNTP 2 μL，5×FS Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL， SuperScriptTMⅢ 0.5 μL，RNase inhibiter 0.5 μL，SIV上游引物、PRRSV下游引物各1 μL。反轉錄條件為：42℃ 60 min，75℃15 min。

1.6 雙重RT-PCR方法的建立 反應體系為：10×buffer 2.5 μL，cDNA 2 μL，dNTP(10 mM)2 μL，Taq酶5 u，引物各1 μL，滅菌去離子水補足至25 μL，混勻后以不同的退火溫度、延伸溫度和時間及循環(huán)次數等進行優(yōu)化。

1.7 PCR產物鑒定 PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。檢測陽性的PCR產物由英濰捷基北京公司測序。

1.8 敏感性試驗 將收獲的PRRSV BJ株病毒液用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋為1×105TCID50/0.1 mL、1×104TCID50/0.1 mL、1×103TCID50/0.1 mL、1×102TCID50/0.1 mL和1×10 TCID50/0.1 mL進行RT-PCR檢測；將SIV H1N1分離株雞胚尿囊液用PBS分別稀釋為 1×104EID50/0.1 mL、1×103EID50/0.1 mL、1×102EID50/0.1 mL、1×10 EID50/0.1 mL和 1 EID50/0.1 mL進行RT-PCR檢測。同時，相應稀釋兩種病毒各取100 μL混合后提取RNA進行PCR擴增。

1.9 特異性試驗 對CSFV、陰性雞胚尿囊液與PRRSV BJ株、SIV H1N1、SIV H3N2同時提取RNA并反轉錄，提取PRV、PPV、PCV2 DNA，同時進行PCR擴增。

1.10 雙重RT-PCR的應用 將12份疑似病料分別研磨，制成混懸液，4℃3000 r/min離心10 min，取上清液。將各樣品上清液分為3份，一份用于雙重RT-PCR檢測，一份接種雞胚分離病毒，一份接種Marc-145細胞分離病毒，比較檢測結果。

2 結果

2.1 雙重RT-PCR反應的建立 對雙重RT-PCR反應體系的退火和延伸溫度、時間以及循環(huán)次數進行優(yōu)化，確定反應條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s、51℃ 30 s、72℃ 1 min，35次循環(huán)；72℃ 3 min。利用引物M-F、M-R和P-F、P-R在同一個反應體系中按上述方法擴增出PRRSV基因組中520 bp和SIV基因組中325 bp 2個片段(圖1)。

圖1 雙重RT-PCR擴增結果電泳圖Fig.1 Detection of PRRSV,SIV and AIV by duplex RT-PCR amplification

2.2 PCR產物的鑒定 將RT-PCR產物純化，連接到pGEM-T載體中測序。測序結果用DNAStar軟件與GenBank中登錄序列進行BLAST分析，結果表明擴增的特異性片段與GenBank登錄的兩種病毒核酸序列的同源性均達98%以上。

2.3 敏感性試驗 結果表明：SIV和PRRSV單重RT-PCR的最低有效檢測量分別為10 EID50/0.1 mL和102TCID50/0.1 mL；所建立的雙重RT-PCR檢測方法SIV和PRRSV的最低有效檢測量分別為102EID50/0.1 mL 和 103TCID50/0.1 mL(圖 2)。

2.4 特異性試驗 對8種病毒的DNA進行雙重PCR檢測，結果顯示：PRRSV BJ株、SIV H1N1、SIV H3N2擴增得到特異性條帶，而CSFV、PRV、PPV、PCV2及陰性雞胚尿囊液均未見擴增條帶，表明引物的特異性較高，適合SIV和PRRSV雙重PCR 檢測(圖 3)。

2.5 雙重RT-PCR的應用 利用建立的雙重RT-PCR方法對臨床12份疑似病料樣品進行檢測，結果顯示：12份疑似病料樣品中7份為PRRSV單獨感染，2份為SIV單獨感染，3份為PRRSV和SIV混合感染。

病毒分離結果顯示：7份PRRSV單獨感染樣品和2份混合感染樣品用Marc-145細胞均分離到PRRSV，另外1份用雙重RT-PCR檢測為雙陽性的混合感染病料樣品未分離到PRRSV，2份SIV單獨感染樣品和3份混合感染樣品用雞胚均分離到SIV，表明雙重RT-PCR檢測與病毒分離結果基本相符。

圖2 PRRSV和SIV RT-PCR敏感性試驗Fig.2 Sensitivity test of the RT-PCR assay for detection of PRRSV and SIV

3 討論

本研究利用擴增SIV和PRRSV的特異性引物建立了雙重RT-PCR檢測方法，該雙重RT-PCR方法敏感、特異。其中，反轉錄選用特異性引物，減少了非特異性條帶的產生。本實驗也曾改變引物濃度以期獲得更好的擴增效果，但最終效果并不明顯。有試驗表明先加入大片段引物進行PCR擴增若干循環(huán)后，再加入小片段引物進行多聯(lián)PCR擴增，取得了較好的效果[6]，但該方法程序比較繁瑣。

圖3 雙重RT-PCR特異性試驗Fig.3 Specificity test of the duplex RT-PCR amplification

對于雙重RT-PCR方法的敏感性，本研究用相同的條件分別進行了SIV和PRRSV的單重和雙重RT-PCR敏感性試驗，結果顯示SIV單重和雙重RT-PCR的最低有效檢測量比Lee建立的單重RT-PCR(1 EID50/mL)和 SIV H1N1、H1N2、H3N2 多重RT-PCR檢測方法(10 EID50/mL)的最低有效檢測量低，可能是因為Lee設計引物依據于不同亞型的特異片段，而本研究的引物依據于不同亞型的共同保守片段，更為重要的是Lee基于DPO(Dual priming oligonucleotide system)技術，該技術可以極大的提高PCR的敏感性與特異性[7]。本方法的PRRSV單重RT-PCR和雙重RT-PCR的最低有效檢測量分別為102TCID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL，比Hirohito建立的多重RT-PCR的最低有效檢測量(1×103TCID50/0.2 mL 和 2×103TCID50/0.2 mL)略高[6]。雖然多重RT-PCR的敏感性受到多種因素的影響，目前也無具體判定標準，但是它基于PCR技術所表現(xiàn)出的靈敏性足以滿足臨床檢測要求。

利用雙重RT-PCR對臨床12份疑似病料樣品進行檢測，其中1份病料樣品應用雙重RT-PCR檢測為SIV和PRRSV混合感染，但僅分離到SIV，可能是因為不同的PRRSV毒株對Marc-145細胞的適應性不同，所以出現(xiàn)該情況屬正常，表明傳統(tǒng)的病毒分離存在靈敏度低的缺點。

本研究建立的雙重RT-PCR方法具有敏感、特異、快速、可重復等優(yōu)點，檢測病原只需4 h～5 h，為SIV和PRRSV混合感染的快速檢測和流行病學調查奠定基礎。

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