應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV變異株在仔豬體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

榮福龍，劉永剛，孫廣力，王淑杰，王洪峰，石文達(dá)，李麗琴，徐明明，孫 剛，田志軍，蔡雪輝*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 哈爾濱 150090)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的，以妊娠母豬繁殖障礙、仔豬及育肥豬呼吸道病癥為主要特征的傳染病[1]。1987年該病首先發(fā)現(xiàn)于美國，此后呈全球性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。1996年郭寶清等報(bào)道我國首例PRRS并分離得到PRRSV CH-1a株[2]。2006年5月我國大部分省市先后暴發(fā)了以高熱為主要特征的“豬高熱病”，研究結(jié)果表明該病的主要病原為高致病性PRRSV變異株[3]。

熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)具有靈敏度高、快速、簡(jiǎn)捷、結(jié)果直觀、重復(fù)性好、可定量分析等優(yōu)點(diǎn)[4]。PRRSV在機(jī)體內(nèi)的分布和含量的高低對(duì)研究該病的致病機(jī)理起著至關(guān)重要的作用。常規(guī)方法檢測(cè)PRRSV在動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布時(shí)，僅能做到定性和半定量分析，不能確定PRRSV在動(dòng)物組織內(nèi)的精確拷貝數(shù)，而FQ-PCR可以解決這一問題。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用建立的PRRSV熒光定量RT-PCR方法對(duì)不同代次PRRSV變異株在仔豬體內(nèi)的分布進(jìn)行定量分析，檢測(cè)PRRSV在仔豬體內(nèi)各器官的分布和載量，明確PRRSV的分布特點(diǎn)和動(dòng)態(tài)規(guī)律，確定不同代次PRRSV變異株的主要嗜性器官，為研究PRRSV的致病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 高致病性PRRSV變異株(HuN4株)及其經(jīng)Marc-145細(xì)胞傳65代致弱的HuN4-F65均由本實(shí)驗(yàn)室保存；熒光定量RT-PCR所需的標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒由韋天超博士提供[5]；40日齡健康仔豬購自哈爾濱周邊某豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 LSIVET SUIS PRRS抗體檢測(cè)試劑盒購自LSI公司；RNeasy Plus Mini RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；RNA酶抑制劑、禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、ExTaqDNA聚合酶(Hot Start Version)購自TaKaRa公司；RotorGene3000熒光定量PCR儀為Corbett公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及感染試驗(yàn) 40日齡健康仔豬40頭，經(jīng)RT-PCR和ELLSA檢測(cè)PRRSV陰性。隨機(jī)分為3組，感染組各16頭，對(duì)照組8頭，分別接種感染 HuN4株(2×105TCID50/mL)、HuN4-F65株(2×105TCID50/mL)和PBS，感染劑量均為肌注1 mL，滴鼻2 mL。觀察臨床癥狀并測(cè)定直腸溫度，分別于感染后1 d～28 d迫殺對(duì)照組1頭、HuN4組2頭、HuN4-F65組2頭。采血、分離血清并采集肺、頜下淋巴結(jié)、扁桃體、肝、十二指腸和腦組織備用。

1.4 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 取感染后不同時(shí)間采集的各器官，按照RNeasy Plus Mini RNA試劑盒說明書提取總RNA。利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，程序?yàn)椋?5℃ 10 min，42℃1 h，0℃2 min。

1.5 FQ-PCR檢測(cè) 分別以cDNA為模板按照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)。對(duì)各時(shí)間點(diǎn)采集的器官及血清的病毒載量取對(duì)數(shù)，比較對(duì)照組、HuN4組和HuN4-F65組在不同時(shí)間點(diǎn)各器官及血清中的增殖情況，分析PRRSV的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 在感染后的5 d～9 d，HuN4組仔豬體溫達(dá)峰值，之后逐漸下降，試驗(yàn)后期體溫接近于對(duì)照組；HuN4-F65組體溫與對(duì)照組相近(圖1)。HuN4組在試驗(yàn)初期出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降，并伴有咳嗽和打噴嚏等癥狀；中期耳部發(fā)紺，后軀麻痹，呈犬臥姿勢(shì)；后期出現(xiàn)不同程度的腹瀉，并伴有神經(jīng)癥狀；部分仔豬的耳部、腹部及尾部發(fā)紺，體溫降低。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)仔豬死亡9頭，病死率為56%，個(gè)別仔豬在后期恢復(fù)。HuN4-F65組主要表現(xiàn)為輕度的咳嗽，精神狀態(tài)正常，未出現(xiàn)典型的臨床癥狀。對(duì)照組仔豬無明顯癥狀。

2.2 剖檢變化 HuN4組病理變化顯著，特別是在感染后7 d和10 d，肺臟表面大面積出血、淤血，個(gè)別處有壞死灶，肺水腫。頜下淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血。除腦、心臟外，其他各器官表面均有不同程度的出血。但是，在感染后21 d和28 d只有肺臟、頜下淋巴結(jié)和扁桃體小面積出血，其他器官無明顯變化。HuN4-F65組個(gè)別仔豬的肺組織、腎臟輕度淤血，淋巴結(jié)輕度腫大，其他各器官均無明顯可視病變。對(duì)照組各臟器均未見異常變化。

圖1 攻毒后各組實(shí)驗(yàn)豬體溫變化曲線Fig.1 Temperature curve of the inoculated pigs

2.3 PRRSV在感染仔豬各器官及血清中的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律

2.3.1 腦 在感染后1 d～21 d，HuN4組在腦部的病毒載量高于HuN4-F65組。HuN4組在感染后1 d在腦部檢測(cè)到PRRSV載量為2.8×106copies/g，而HuN4-F65組在感染后的1 d、3 d和5 d未檢測(cè)到PRRSV，表明HuN4株對(duì)腦的嗜性強(qiáng)于HuN4-F65株。HuN4組的病毒載量與感染時(shí)間呈正相關(guān)，在感染后7 d病毒載量達(dá)到峰值，為1.8×1010copies/g，隨后病毒載量呈下降趨勢(shì)，在感染后28 d病毒載量達(dá)到最低；HuN4-F65組在感染后7 d可以檢測(cè)到PRRSV，感染后14 d達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)；對(duì)照組未檢測(cè)到PRRSV(圖2)。

圖2 PRRSV在腦中病毒載量變化曲線Fig.2 PRRSV viral load in the pig brain

2.3.2 十二指腸 在感染后1 d～28 d十二指腸HuN4組的病毒載量高于HuN4-F65組。前者在感染后1 d可在十二指腸檢測(cè)到PRRSV，病毒載量在感染后3 d開始上升，7 d達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)。HuN4-F65組在感染后5 d可以檢測(cè)到PRRSV，14 d達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)，在感染后28 d未檢測(cè)到PRRSV。對(duì)照組呈陰性(圖3)。

圖3 PRRSV在十二指腸中病毒載量變化曲線Fig.3 PRRSV viral load in the pig duodenum

2.3.3 扁桃體 在感染后3 d～28 d HuN4組扁桃體的病毒載量高于HuN4-F65組。前者病毒載量在感染后呈直線上升趨勢(shì)，感染后7 d達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)；后者在感染后1 d于扁桃體可以檢測(cè)到PRRSV，病毒載量高于HuN4組，在感染后3 d仍可檢測(cè)到較高的病毒載量(5.0×107copies/g)，在感染后14 d達(dá)到峰值(1.0×108copies/g)，后期仍保持較高的病毒載量，表明扁桃體是HuN4-F65株的主要嗜性器官；對(duì)照組呈陰性(圖4)。

2.3.4 頜下淋巴結(jié) 除感染后3 d，在其他各時(shí)期HuN4組頜下淋巴結(jié)的病毒載量均高于HuN4-F65組，HuN4組感染后1 d頜下淋巴結(jié)可以檢測(cè)到PRRSV，而HuN4-F65組未檢測(cè)到PRRSV。HuN4組在感染后3 d病毒載量迅速上升，在感染后7 d達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢(shì)，但后期仍具有較高的病毒載量。HuN4-F65組在感染后3 d可以檢測(cè)到較高的病毒載量，達(dá)1.8×108copies/g，高于HuN4-F65組其他各器官，其中病毒載量的峰值期出現(xiàn)在感染后7 d，早于HuN4-F65組其他各器官，并且病毒載量高達(dá) 3.0×108copies/g，表明頜下淋巴結(jié)也是HuN4-F65株的主要嗜性器官。對(duì)照組呈陰性(圖5)。

圖4 PRRSV在扁桃體中病毒載量變化曲線Fig.4 PRRSV viral load in the pig tonsil

圖5 PRRSV在頜下淋巴結(jié)中病毒載量變化曲線Fig.5 PRRSV viral load in the pig submandibular lymph nodes

2.3.5 肺臟 在感染后1 d～28 d HuN4組肺臟的病毒載量明顯高于HuN4-F65組，在感染后7 d達(dá)到峰值，為1.0×1011copies/g，明顯高于HuN4組其他各器官，而且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均具有較高的病毒載量，表明肺臟為HuN4株的主要嗜性器官。HuN4-F65組在感染后1 d和3 d未檢測(cè)到PRRSV，并且，在感染后5 d～28 d病毒載量的波動(dòng)不明顯，各時(shí)間點(diǎn)的病毒載量較低，只是在感染后10 d病毒載量略高于其他各時(shí)間點(diǎn)(圖6)，提示HuN4-F65株在肺臟的復(fù)制能力明顯低于HuN4株。對(duì)照組呈陰性。

2.3.6 肝臟 在試驗(yàn)期間HuN4組肝臟的病毒載量高于HuN4-F65組，在感染后1 d～7 d肝臟的病毒載量呈上升趨勢(shì)，但上升速度比扁桃體、淋巴結(jié)和肺臟慢。在感染后7 d病毒載量達(dá)峰值，隨后呈下降趨勢(shì)(圖7)。HuN4-F65組在感染后1 d、3 d和5 d未檢測(cè)到PRRSV，病毒載量的峰值期出現(xiàn)于感染后14 d，隨后也呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組呈陰性。

圖6 PRRSV在肺臟中病毒載量變化曲線Fig.6 PRRSV viral load in the pig lung

圖7 PRRSV在肝臟中病毒載量變化曲線Fig.7 PRRSV viral load in the pig liver

2.3.7 血清 HuN4組血清病毒載量在感染后1 d～14 d高于HuN4-F65組，21 d～28 d接近HuN4-F65組，感染后5 d病毒載量達(dá)到峰值，后期有所下降；HuN4-F65組在試驗(yàn)期間病毒載量波動(dòng)不明顯，后期出現(xiàn)輕度下降趨勢(shì)；對(duì)照組呈陰性(圖8)。

3 討論

圖8 PRRSV在血清中病毒載量變化曲線Fig.8 PRRSV viral load in the pig serum

本研究采用滴鼻、肌注的方式感染仔豬。結(jié)果表明：HuN4組各器官在感染后5 d～21 d的病毒載量明顯高于HuN4-F65組，其中，部分器官在感染后1 d～7 d差異較大，并且HuN4組各器官病毒載量峰值期出現(xiàn)在感染后7 d，比HuN4-F65組提前3 d～7 d。汪銘書等報(bào)道PRRSV在體內(nèi)可誘導(dǎo)肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肝臟和腦等組織的細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞數(shù)目隨感染時(shí)間的延長在感染后7 d達(dá)到峰值，之后減少[12]。宿主細(xì)胞凋亡動(dòng)態(tài)變化規(guī)律與本實(shí)驗(yàn)HuN4組各器官病毒載量的變化規(guī)律相一致，表明病毒的復(fù)制與靶細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

HuN4株在全身各組織器官廣泛分布，感染后該株病毒增殖速度快，表明HuN4株在感染后對(duì)靶細(xì)胞的嗜性明顯強(qiáng)于HuN4-F65株。HuN4組各器官病毒載量變化和體溫變化存在相關(guān)性，均在感染后7 d左右達(dá)到峰值，而HuN4-F65組無此規(guī)律，這種致病性差異可能與PRRSV的毒力有關(guān)。本研究在HuN4組的腦組織中檢測(cè)到PRRSV核酸，其中某些病例還發(fā)生典型的神經(jīng)癥狀，表明PRRSV變異株可以突破血腦屏障，與Tian等報(bào)道一致[6]。劉永宏等報(bào)道PRRSV對(duì)消化系統(tǒng)產(chǎn)生損傷[7]，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅HuN4-F65組在感染后1 d和28 d未檢測(cè)到病毒外，其他各時(shí)期HuN4組和HuN4-F65組仔豬的十二指腸內(nèi)均檢出PRRSV，表明PRRSV主要侵入的消化道器官為十二指腸。Beyer等通過免疫熒光方法對(duì)感染PRRSV歐洲株的仔豬各器官的病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)在感染后2 d～4 d病毒含量最高，肺臟在感染后7 d病毒含量最高[8]，而本實(shí)驗(yàn)HuN4組的結(jié)果是淋巴結(jié)和肺臟均在感染后7 d病毒含量達(dá)到峰值，推測(cè)可能是由于感染的毒株不同所致。PRRSV對(duì)肺臟的親嗜性最高，主要侵害巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞[9-10,13]，與本實(shí)驗(yàn)HuN4組檢測(cè)的結(jié)果相一致，但與HuN4-F65組檢測(cè)的結(jié)果不同。HuN4-F65株對(duì)頜下淋巴結(jié)和扁桃體有較高的嗜性，而對(duì)肺臟不敏感，這與任慧英等報(bào)道的結(jié)果相吻合[11]，表明PRRSV在致弱的過程中對(duì)豬體的適應(yīng)性減弱，主要局限于單核巨噬細(xì)胞相對(duì)集中的淋巴結(jié)和扁桃體。胡守萍報(bào)道HuN4致弱株在攻毒28 d仍可在多數(shù)淋巴器官被檢出，而且在肺臟持續(xù)時(shí)間短，病毒含量低，提示HuN4致弱株的嗜性器官主要集中在淋巴結(jié)[14]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。導(dǎo)致嗜性器官改變的具體原因，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)表明HuN4組和HuN4-F65組病毒血癥持續(xù)存在，其中HuN4組感染后1 d～14 d血清的病毒載量明顯高于HuN4-F65組，并且HuN4組和HuN4-F65組在感染后1 d即可檢測(cè)到病毒。推測(cè)其原因主要與感染方式有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用滴鼻加肌注的感染方式使病毒直接進(jìn)入豬血液中，縮短了病毒通過血液循環(huán)到達(dá)其他器官的時(shí)間，這可能是部分器官在實(shí)驗(yàn)前期檢測(cè)到病毒的主要原因。HuN4組血清的病毒載量明顯低于各組織的病毒載量，這與韋天超等報(bào)道不一致[5]，推測(cè)其原因可能與未采集到各組織的病毒載量均較高的病死豬的血液有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)HuN4-F65組臨床癥狀和剖檢變化顯示，感染HuN4-F65株的仔豬未發(fā)病，但從各組織的病毒載量分析，仔豬各組織在試驗(yàn)后期始終帶毒，表明較低的病毒載量不會(huì)引起仔豬的臨床癥狀，但是機(jī)體是否能徹底清除病毒，尚需進(jìn)一步研究。

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