柔嫩艾美耳球蟲雜交株對親本株的免疫保護(hù)性研究

魏 峰，殷麗紅，許 越，楊歡歡，張西臣

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是球蟲病爆發(fā)中致病性最強(qiáng)的蟲種之一，主要侵害雞盲腸，通過裂殖體在盲腸上皮細(xì)胞中大量增殖，破壞腸黏膜，引起腸管發(fā)炎和上皮細(xì)胞崩解[1-2]。目前，藥物防治多采用抗生素類和化學(xué)合成藥物，但由于耐藥蟲株的出現(xiàn)及殘留藥物對人體的危害，使藥物防治受到限制[3]。免疫預(yù)防已成為當(dāng)前研究的熱點，但目前對球蟲的免疫機(jī)制尚未完全闡明，同種不同株、不同發(fā)育階段的蟲體抗原成分均存在一定的差異。因此，鑒定其共同保護(hù)性抗原對球蟲疫苗的研制及免疫機(jī)理的研究具有重要的意義。吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲研究室利用E.tenella廣州株、長春株、黑龍江株雜交獲得雜交株，為研究球蟲共同保護(hù)性抗原奠定基礎(chǔ)[4]。本研究通過E.tenella雜交株對其親本株的免疫保護(hù)性實驗，研究雜交株對親本株的免疫保護(hù)及細(xì)胞免疫在球蟲免疫中的作用，從而，為球蟲免疫機(jī)理研究和疫苗研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲株E.tenella廣州株為廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔡建平研究員惠贈；E.tenella長春株及黑龍江株均為吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲研究室保存；E.tenella雜交株為吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲研究室利用E.tenella廣州株、長春株和黑龍江株雜交獲得。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng) 1日齡AA肉雞500只購自吉林德大肉種雞公司，自行配制無抗球蟲藥全價飼料，80℃烘烤1 h，自由采食、飲水，24 h光照，嚴(yán)格消毒，在無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)，10日齡～11日齡連續(xù)2 d糞檢無球蟲卵囊雞用于試驗。

1.3 免疫保護(hù)性檢測

1.3.1 免疫保護(hù)率測定 12日齡時逐只稱重，淘汰體重過大和過小者，400只無球蟲雛雞隨機(jī)分為20組，每組20只；用E.tenella廣州株、長春株、黑龍江株、雜交株各感染4組，劑量為1×104個卵囊/只，設(shè)4個不感染對照組。24日齡時分別用廣州株、長春株、黑龍江株和雜交株對各組雞攻蟲，劑量為103個卵囊/只；攻蟲后7 d進(jìn)行OPG計數(shù)、糞便計分、盲腸病變計分[5]、平均增重和保護(hù)率計算，分析各數(shù)據(jù)(表1)。

保護(hù)率＝(各株空白組攻蟲OPG數(shù)-各株攻蟲后OPG數(shù))/各株空白組攻蟲OPG數(shù)

1.3.2 細(xì)胞免疫檢測 50只12日齡無球蟲AA肉雞隨機(jī)分成1個空白對照組，4個實驗組，每組10只。實驗組12日齡用雜交株感染，劑量為104個卵囊/只，24日齡時分別用廣州株、長春株、黑龍江株和雜交株攻蟲，劑量為103個卵囊/只，攻蟲后10 d，各組雞翅下采血1 mL，抗凝處理后進(jìn)行鼠抗雞CD4+T、CD8+T單克隆抗體(MAb)標(biāo)記，標(biāo)記血樣利用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T、CD8+T細(xì)胞水平，比較各親本株攻蟲后對雞細(xì)胞免疫的影響(表2)。

表1 雜交株及各親本株免疫保護(hù)性Table 1 Immuneprotection of chickens immunized withE.teuellahybrid strain against different parent strain challenging(n=20)

表2 雜交株免疫雛雞對親本株攻蟲后CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測Table 2 CD4+T and CD8+T cell level of chickens immunized with hybird strain and challenged by parent strains(n=10)

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫保護(hù)率結(jié)果 表1結(jié)果顯示：E.tenella雜交株、廣州株、長春株和黑龍江株對同株的免疫保護(hù)率分別為87.7%、83.6%、72.5%和75.1%；廣州株、長春株和黑龍江株對其它親本株的平均免疫保護(hù)率為64.9%、60.4%和65.1%，而雜交株免疫的雛雞對廣州株、長春株和黑龍江株3個親本株的免疫保護(hù)率分別為83.9%、79.1%和81.2%，平均為81.4%，極顯著高于其它地理株的交叉保護(hù)率(p<0.01)。雜交株對其親本株的免疫保護(hù)率較高，而各親本株對其他株的攻蟲免疫保護(hù)率較低，免疫保護(hù)率順序為：雜交株(81.4%)>黑龍江株(65.1%)>廣州株(64.9%)>長春株(60.4%)，雜交株可能遺傳了3個親本株的某些性狀(如抗原等)，特別是雜交株對長春株和黑龍江株的免疫保護(hù)率高于其他株，其原因有待于進(jìn)一步研究。而盲腸病變計分和糞便計分試驗結(jié)果顯示：雜交株顯著低于廣州株、長春株和黑龍江株(p<0.05)；所有免疫組雛雞平均增重均高于空白對照組，表明經(jīng)過免疫后雛雞獲得保護(hù)力，能夠抵抗球蟲的再次感染。各株的致病性有明顯差異，其順序為(以O(shè)PG計)：廣州株>長春株>黑龍江株>雜交株，雜交株致病性較弱而其免疫保護(hù)率較高。對球蟲免疫研究顯示，不同種的球蟲抗原存在差異，同種不同株間也存在著抗原差異，同一個體的不同發(fā)育階段抗原也不相同。本實驗結(jié)果表明E.tenella廣州株、長春株和黑龍江株之間存在抗原差異。

2.2 細(xì)胞免疫結(jié)果 表2結(jié)果顯示：4個試驗組的雛雞外周血液中CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對照組，其中以雜交株和廣東株較高，各組引起的CD4+T數(shù)量增加明顯高于CD8+T數(shù)量增加，CD4+T/CD8+T差別不大，表明不同雜交株球蟲感染能夠引起明顯的細(xì)胞免疫。在球蟲的免疫機(jī)制中抗體的作用很小[6]，CD4+T、CD8+T細(xì)胞在免疫中發(fā)揮著重要作用[7-8]，本實驗中，CD4+T、CD8+T細(xì)胞在攻蟲10 d后其數(shù)量均有明顯增加，尤其是CD4+T細(xì)胞增加較多，試驗組CD4+T/CD8+T比值顯著高于對照組。該實驗結(jié)果與Shirle對耐藥雜交株可耐受多種藥物的結(jié)果相似，也與吉林大學(xué)分子寄生蟲學(xué)研究室的研究結(jié)果相似[9-10]。這些研究為雞球蟲活苗在不同地區(qū)的正確使用提供了依據(jù)，為下一步找出球蟲保護(hù)性抗原奠定了基礎(chǔ)。

[1]Dalloul R A,Lillehoj H S.Recent advances in immunomo-dulation and vaccination strategies against coccidiosis[J].Avian Dis,2005,49:1-8.

[2]Allen P C,Fetterer R H.Recent advances in biology and immunobiology of Eimeriaspecies and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry[J].Clin Microbiol Rev,2002,15:58-65.

[3]Vertommen M H,Deek H W.How can a resistance problem be broken[J].World Poultry,1993,9:19-21.

[4]趙權(quán)，張西臣.不同地理株及其雜交株柔嫩艾美耳球蟲免疫保護(hù)性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，27(1)：100-103.

[5]索勛，李國清.球蟲病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998，357-396.

[6]段嘉樹，程金科，趙樹英，等.球蟲疫苗免疫防治縱橫談[J].當(dāng)代畜牧，1994，12：13-20.

[7]查紅波，蔣金書.球蟲保護(hù)性免疫機(jī)制[J].中國獸醫(yī)雜志1997，23(11)：47-48.

[8]Arakawa A,Xie M Q.Control of coccidiosis in chickens[J].J Protozool Res,1993,3:31-39.

[9]Shirley M W.A molecular karyotype of Eimeria tenellaasrevealed by contourclamped homogenous electric field gel electrophoresis[J].Mol Biochem Parasitol,1990,38:169.

[10]張偉信，張西臣，李建華，等.五種不同地理株柔嫩艾美耳球蟲免疫保護(hù)性比較[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，4：454-456.