青海省部分地區(qū)牛奶中幾種微生物指標的檢測

李桂蘭

（青海省動物疫病預防控制中心，青海 西寧 810006）

牛奶安全關系到消費者的身體健康，影響牛奶安全的因素較多，須對其進行全面的檢測，檢測項目主要包括微生物檢測、化學物質檢測、殘渣檢測等。當乳牛受到飼養(yǎng)管理、疾病、氣溫以及其他各種因素（包括人工造假）的影響時，乳的成分和性質往往發(fā)生變化，這種乳不適于加工優(yōu)質的產(chǎn)品，極可能對消費者造成健康隱患，所以必須對奶制品進行檢測[1]。牛奶安全的檢測對保證使用者的健康有著非常重要的意義。

微生物的污染是引起乳及乳制品變質的重要原因。在乳及乳制品加工過程中的各個環(huán)節(jié)如滅菌、過濾、濃縮、發(fā)酵、干燥、包裝等，都可能因為不按操作規(guī)程生產(chǎn)加工而造成微生物污染。所以在乳及乳制品的加工過程中，對所有接觸到乳及乳制品的容器、設備、管道、工具、包裝材料等都要進行徹底的滅菌，防止微生物的污染，以保證產(chǎn)品質量[2]。另外在加工過程中還要防止機械雜質和揮發(fā)性物質(如汽油)等的混入和污染。原料乳衛(wèi)生質量的優(yōu)劣直接關系到乳及乳制品的質量。原料的衛(wèi)生質量問題主要是病牛乳(結核病、乳房炎牛的乳)、高酸乳、胎乳、初乳，應用抗生素五天內的乳、摻偽乳以及變質乳等。

1 材料與方法

1.1 檢測方法

1.1.1 檢測方法

本檢測方法均按中華人民共和國國家標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》GB/T4789-2003中《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，GB/T4789.3-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 大腸菌群測定》，GB/T 4789.4-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》要求檢驗方法進行檢驗。

1.1.2 檢測項目

檢驗項目為細菌總數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌。

1.2 材料

1.2.1 樣品

青海省部分地區(qū)8批次70份鮮牛奶樣品。

1.2.2 器械[3]

0℃～4℃冰箱，36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱，46℃±1℃恒溫水浴鍋，均質器或滅菌乳缽，0g～500g架盤藥物天平，菌落計數(shù)器，4×放大鏡，10×～100×顯微鏡，1mL（具 0.01mL刻度）、10mL（具0.01mL刻度）滅菌吸管，500mL滅菌錐形瓶，直徑5mm滅菌玻璃珠，直徑90mm滅菌培養(yǎng)皿，16mm×160mm滅菌試管，3mm×50mm滅菌小試管，滅菌毛細管、刀、剪子、鑷子等。

1.2.3 培養(yǎng)基和試劑

1.2.3.1 菌落總數(shù)測定

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；硫酸鹽緩沖液；0.85%滅菌生理鹽水；75%乙醇。

1.2.3.2 大腸菌群測定

乳糖膽鹽發(fā)酵管，伊紅美蘭瓊脂平板，乳糖發(fā)酵管，EC肉湯；革蘭氏染色液。

1.2.3.3 沙門氏菌測定

緩沖蛋白胨水（BP），氯化鎂孔雀綠（MM）增菌液，四硫酸鈉煌綠（TTB）增菌液，亞硫酸鹽胱氨酸（CC）增菌液，亞硫酸鉍瓊脂（BS），DHL瓊脂，HE瓊脂，WS瓊脂，SS瓊脂，三糖鐵瓊脂，蛋白胨水、定基質試劑，尿素瓊脂（pH7.2），氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基，糖發(fā)酵管，ONPG培養(yǎng)基，半固體瓊脂，丙二酸鈉培養(yǎng)基。沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；57種用于進一步分型；163種用于詳細分型。

1.3 方法[3]

1.3.1 菌落總數(shù)測定方法

1.3.1.1 以無菌操作將檢樣25mL放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內，經(jīng)充分振搖做成1:10的均勻稀釋液。

1.3.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1:100的稀釋液。

1.3.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上調操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。

1.3.1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。

1.3.1.5 稀釋液移入培養(yǎng)皿后，及時將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±1℃水浴恒保溫）注入培養(yǎng)皿約15mL，并轉動培養(yǎng)皿使混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內做空白對照。

1.3.1.6 待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36℃±1℃溫箱內培養(yǎng)48h±2h。

1.3.1.7 菌落計數(shù)方法

做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。

1.3.2 大腸菌群測定方法

1.3.2.1 以無菌操作將檢樣25mL放于含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數(shù)量的玻璃珠），經(jīng)充分振搖做成1:10的均勻稀釋液[4]。

1.3.2.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管，混合均勻，做成1:100的稀釋液。

1.3.2.3 另取1mL滅菌吸管，按上調操作方法，做10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。

1.3.2.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇3個適宜稀釋度，每個稀釋度，接種3管。

（1）乳糖發(fā)酵試驗

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36℃±1℃溫箱內，培養(yǎng)18h～24h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。

（2）分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美蘭瓊脂平板上，置36℃±1℃溫箱內，培養(yǎng)48h±2h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實試驗。

在上述平板上，挑取可疑大腸菌群1個～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，置36℃±1℃溫箱內，培養(yǎng)24h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。

1.3.3 沙門氏菌測定方法

1.3.3.1 前增菌和增菌

以無菌操作取25mL，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的廣口瓶內。移取10mL，轉于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液內，于42℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取10mL，轉種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于36℃±1℃培養(yǎng) 18h～24h。

1.3.3.2 分離

取增菌液一環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板。兩種細菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h，觀察各個平板上生長的菌落，沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙門氏菌Ⅲ在各個平板上的菌落特征見表1。

1.3.3.3 生化試驗

自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂內，腸桿菌科常見屬種的反應結果見表2。

表2說明在三糖鐵瓊脂內只有斜面產(chǎn)酸并同時硫化氫（H2S）陰性的菌株可以排除，其他的反應均有沙門氏菌的可能，同時也均有不是沙門氏菌的可能。

2 結果

2.1 評價標準

評價按照《食品衛(wèi)生國家標準》進行評價。凡樣品中有一項或一項以上指標不符合標準則定為不合格樣品。

?

?

2.2 檢測結果

8批次70份鮮牛奶檢測中菌落總數(shù) (Cfu／mL)介于 6.3×104與3.6×105之間，平均為 1.4×105；大腸菌群(MPN／100mL)是 1.5×104與1.4×105之間，平均為 7.6×104，均低于國標 GB/T4789.1～4789.31—2003的要求（菌落總數(shù)：5.0×105，大腸菌群：1.0×105）。沙門氏菌檢測均為陰性。詳見表3。

?

3 討論

3.1 2008年的三聚氰胺事件，包括三鹿奶粉在內的國內其他名牌產(chǎn)品都存在類似問題，建議除了加強對三聚氰胺等化學添加劑的監(jiān)測外，還需加強對病原微生物監(jiān)測。

3.2 雖然整體平均符合國標要求，但是部分批次的單個樣品有超標的情況，這可能與以下幾個方面有關，一是養(yǎng)殖環(huán)境較差，病原微生物滋生導致。二是擠奶環(huán)節(jié)沒有按照規(guī)定操作，比如擠奶前沒有對乳頭進行清洗消毒，致使糞便污染乳頭所致；盛奶容器消毒達不到要求。三是個別奶牛存在隱性乳房炎，導致鮮奶質量不符合要求。四是雖然部分企業(yè)開始集約化養(yǎng)殖，但是其管理模式尚與蒙牛、伊利等大型企業(yè)存在較大差距，尤其在龍頭帶動農戶的模式中存在監(jiān)管不力，質量難以控制的情況。

3.3 本實驗按照GB/T4789.2—2003食品微生物學檢驗完成，該規(guī)范在鮮奶微生物檢測中存在規(guī)范不清、沒有具體判定數(shù)值標準等情況，建議國家有關部門提出針對鮮乳中微生物檢驗的相應國家標準和規(guī)范。

3.4 建議我省奶牛養(yǎng)殖中提高規(guī)模化和規(guī)范化養(yǎng)殖水平，并提高動物防疫水平；與此同時建議動物衛(wèi)生監(jiān)督部門和動物防疫部門加強市場檢疫和源頭檢測，整體上提高我省鮮奶質量，進而全面提高我省該方面食品安全水平。

3.5 加強宣傳力度，大力宣傳食品衛(wèi)生相關知識，強化廣大人民群眾的食品衛(wèi)生安全意識，從而逐步努力營造人人參與食品安全、全社會重視支持食品安全的良好氛圍，讓消費者喝上安全衛(wèi)生的牛奶制品。

3.6 青海地區(qū)幅員遼闊，是全國五大牧區(qū)之一，畜牧業(yè)在青海有廣闊的發(fā)展前景，而奶業(yè)在全省有獨特的優(yōu)勢。把優(yōu)勢轉化為發(fā)展經(jīng)濟的亮點，就要求奶業(yè)從事者從基礎抓起，確保乳制品的質量過關。廣大的質量監(jiān)督員也要履行本職工作，為奶業(yè)經(jīng)濟把好關。乳制品質量檢測任重道遠，相關檢測技術亟待發(fā)展進步。

[1]張彥明，佘銳萍.動物性食品衛(wèi)生學[M].3版.北京:中國農業(yè)出版社，2007.

[2]張建新.食品質量安全技術標準法規(guī)應用指南[M].北京:科學技術文獻出版社，2002.

[3]GB/T4789.2－2003食品衛(wèi)生微生物學檢驗菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標準出版社，2003.

[4]張彥明，賈靖國.動物性食品衛(wèi)生檢驗技術[M].西安:西北大學出版社，1995.

[5]郭本恒.現(xiàn)代乳品加工學[M].北京:中國輕工業(yè)出版社，2001.

[6]于莉，羅章，孟云.西藏地區(qū)牦牛乳理化和微生物指標的檢測分析[J].中國乳品工業(yè)，2006，34(9):108-111.

[7]藺長明，王占江，李振舉.無公害畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)和認證[J].中國動物檢疫，2003，20（7）：1-2.

[8]李莎燕，馬文瑞，褚明德.門源縣奶牛養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展對策[J].青海畜牧獸醫(yī)雜 志，2008，38（5）:37-38.

[9]閻萍，潘和平.牦牛乳業(yè)的開發(fā)和利用[J].中國乳業(yè)，2004(7):10-121.

[10]李萬財，尚海忠，李俊花，等.天峻地區(qū)牦牛乳中微生物含量的測定[J].中國動物檢疫，2002，19(3):361.

[11]張福年.民和縣奶牛生產(chǎn)的現(xiàn)狀及對策 [J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2008，38（5）:39-40.