泛素-蛋白酶體通路與腫瘤發(fā)生的研究進展

張丹丹綜述 張玉泉審校

泛素-蛋白酶體復(fù)合通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是Hershko等在20世紀末發(fā)現(xiàn)的1種高效蛋白質(zhì)降解通路，該通路通過蛋白酶體選擇性降解細胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)，不但能夠破壞損傷陳舊的蛋白質(zhì)，而且能夠參與調(diào)節(jié)細胞的多種重要生命過程，精確降解細胞內(nèi)各種目的靶蛋白，進而參與基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)節(jié)，以及受體胞吞、抗原呈遞等各種細胞生理過程［1］。UPP的發(fā)現(xiàn)被認為是細胞周期、細胞惡性轉(zhuǎn)化和免疫學(xué)研究的轉(zhuǎn)折點。目前的研究顯示，UPP與一系列女性生理過程和婦科疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。

1 泛素的結(jié)構(gòu)

泛素只存在并廣泛存在于真核生物，是由76個氨基酸組成的多肽，相對分子量為8.45×103，是1種非常小的球形蛋白，常常通過與其他蛋白共價結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。泛素屬于熱休克基因家屬，具有高度保守性，在人與酵母之間也僅有3個氨基酸的差別。X線衍射分析泛素，包括4個β片層和1個α螺旋，共形成3個半轉(zhuǎn)角，為1個緊密的球形結(jié)構(gòu)。泛素基因有2種典型的存在狀態(tài):1種是Ub基因結(jié)合到核糖體蛋白基因上;另1種是以重復(fù)基因編碼出線形的泛素分子鏈，即多聚泛素分子(polyubiquitinmolecule)。各個泛素單體之間可通過不同的氨基酸殘基連接，并與底物蛋白連接成泛素多聚鏈，具有不同的功能。泛素單體間主要的連接殘基為第48位的賴氨酸(Lys48)，而形成泛素多聚鏈的殘基有Lys6、Lys11、Lys29、Lys63。通過不同的連接，泛素可以標記不同的蛋白底物，連接時都需要ATP水解提供能量。

2 泛素-蛋白酶體通路

泛素-蛋白酶體通路是生物體內(nèi)進行蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一。主要包括泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素連接酶(ubi-quitin-conjugating enzyme，E2)、泛素蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligating enzyme，E3)、26S蛋白酶體及去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，DUBs)等。動物細胞有2套蛋白酶體:①20S蛋白酶體，負責(zé)蛋白酶的激活并形成26S蛋白酶體的核心;②26S蛋白酶體，負責(zé)催化ATP依賴的泛素化蛋白的降解。

2.1 蛋白質(zhì)泛素化降解途徑

2.1.1 泛素的活化 泛素通過E1和E2被激活的過程稱為泛素的活化。泛素的活化過程是1個依賴ATP的酶促反應(yīng)(見圖1):①首先由ATP提供能量，泛素C末端的甘氨酸(Gly)被泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme E1)催化，形成Ub-腺苷酸中間產(chǎn)物，C末端被激活，然后激活的C末端被轉(zhuǎn)移至E1酶內(nèi)Cys殘基的-SH鍵上，形成高能硫酯鍵;②通過轉(zhuǎn)?；饔?，含有高能硫酯鍵的泛素進一步轉(zhuǎn)移到泛素載體蛋白(ubiquitin conjugating enzyme，E2)特異的Cys殘基上，形成E2-Ub巰基酯，E2-Ub巰基酯可使泛素C端甘氨酸與底物蛋白的Lys殘基的氨基形成共價鍵;③在大多數(shù)情況下，底物蛋白先與泛素連接酶(ubiquitin ligating enzyme，E3)特異性結(jié)合，E3可使E2和底物蛋白相互接近，繼而蛋白底物與E2酶連接的泛素結(jié)合，完成了底物蛋白質(zhì)的泛素化。泛素也可以直接從E2轉(zhuǎn)移給底物蛋白形成Ub蛋白復(fù)合物，這時的底物多為堿性蛋白 (如組蛋白)。泛素連接酶是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的重要成分，在癌形成過程中扮演著重要的角色［2］。

2.1.2 蛋白底物的降解 蛋白底物與泛素形成Ub蛋白復(fù)合物后，特異空間結(jié)構(gòu)被展平，進入26蛋白酶體的催化中心降解。在26S蛋白酶體(proteasome)中(見圖2)，中部20S蛋白酶體呈筒狀外形，由內(nèi)層2個β環(huán)和外層2個α環(huán)組成，α亞基主要用于底物識別，β亞基則負責(zé)底物降解。α亞單位環(huán)組組成20S蛋白酶體圓桶狀結(jié)構(gòu)的兩端，環(huán)口中央被α亞單位N末端肽鏈占據(jù)，使α環(huán)的外側(cè)完全關(guān)閉，其功能是阻止非目的靶蛋白質(zhì)進入20S內(nèi)被降解。近期有一項研究顯示20S亞單位的組裝是由哺乳動物細胞蛋白酶體生物合成的關(guān)鍵因子—蛋白酶體成熟蛋白(proteasomematuration protein，POMP)促進其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)完成［3］。19S調(diào)節(jié)復(fù)合體可分為蓋子(1id)和底座(base)2個次級復(fù)合物，底座位于20S蛋白酶體兩側(cè)，可加速底物泛素化及α環(huán)口開啟，蓋子是多聚泛素蛋白的受體。19S復(fù)合體主要起調(diào)節(jié)作用，特異性識別并結(jié)合泛素化的靶蛋白，改變靶蛋白構(gòu)象。泛素化蛋白被識別后轉(zhuǎn)移至核心蛋白被降解［4］，而負責(zé)“標記”靶蛋白的泛素被解離下來，釋放到胞質(zhì)中循環(huán)重復(fù)使用［5］。

2.1.3 泛素的再循環(huán) 泛素屬于長壽命蛋白，在泛素系統(tǒng)中存在能夠特異切割泛素鏈的C末端的泛素解離酶(DUBs)。在泛素蛋白偶連物水解之前，泛素解離酶將泛素從底物上解離下來。DUBs屬于蛋白酶超家族，根據(jù)其催化機制，可以分為5類(天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)。DUBs能夠特異性識別泛素C末端與相連的最后1個殘基(Gly76)分子之間形成的共價鍵，使其斷開。DUBs促進泛素分子再循環(huán)，是泛素系統(tǒng)的正常運行的必要成分。

圖1 泛素的活化過程

圖2 Ub蛋白復(fù)合物的降解

2.2 泛素-蛋白酶體途徑與腫瘤的關(guān)系

泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，是真核細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，參與細胞凋亡、MHCⅠ類抗原的遞呈、細胞周期以及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，對維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義［6］。有研究認為蛋白質(zhì)的泛肽化與包括細胞凋亡在內(nèi)的許多細胞活動過程有關(guān)［7，8］。UPP通過26S蛋白酶體降解一些與凋亡相關(guān)的蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子，凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等，發(fā)揮調(diào)控細胞凋亡的作用。

2.2.1 UPP對轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控 核因子kappa增強子結(jié)合蛋白 (nuclear factor kappa enhancer binding protein，NF-κB)是細胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，控制著細胞的免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)和凋亡等過程。泛素化調(diào)控著NF-κB活化過程當中的許多步驟:NF-κB的抑制子核因子kappaB抑制子(inhi-bitor of nuclear factor，kappa2B，IκB)的降解，IκB 激酶(IκB kinases，IKK)的活化等［9］。正常情況下細胞轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB活性被I-κB抑制，在誘導(dǎo) NF-κB 的應(yīng)激刺激下，激活 IκB 激酶(IKK)。NF-κB活化過程中，E3酶上的環(huán)指模TRAF6首先被細胞膜上的TNF受體和IL-1受體及其配體激活，然后與E2酶上的1個復(fù)合體泛素變構(gòu)酶1A(ubiqitin emzyme 1A，UBC132UEV1A)共同作用，被K63泛素鏈修飾，K63泛素鏈可被特定的激酶受體蛋白的鋅指模序所識別［10］。泛素化的TRAF6募集相關(guān)的蛋白，以K63鏈為骨架進行裝配信號復(fù)合體，催化IKK的上游激酶TAK1〔轉(zhuǎn)換生長因子(transforming growth factor，TGFβ)激活激酶(TGFβ-activated kinase)〕磷酸化，進而激活 IKK，引起 IκBα磷酸化和泛素化，IκB的空間構(gòu)象發(fā)生變化，從而被ATP依賴性26S的蛋白酶體所識別并降解，這一過程可被蛋白酶體抑制劑所阻斷［11］。IκB 的降解解除了對 NF-κB 的抑制作用，NF-κB被釋放至細胞核，激活抗凋亡基因如bcl-2等，發(fā)揮其抗凋亡作用，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中降解I-κB的蛋白酶體活性增加，細胞內(nèi)NF-κB水平升高。

2.2.2 UPP對p53蛋白的調(diào)控 抑癌基因p53的表達產(chǎn)物可以通過激活靶基因?qū)崿F(xiàn)凋亡調(diào)控功能，是細胞內(nèi)重要的凋亡調(diào)控因子。E3RNG家族成員癌基因調(diào)節(jié)蛋白鼠雙微粒體(murine dou-bleminute 2，MDM2)作為1種癌基因蛋白具有負反饋調(diào)節(jié)p53的作用。MDM2含有環(huán)指樣結(jié)構(gòu)域，具有泛素連接酶E3的作用，可以促進p53產(chǎn)物從核內(nèi)向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運，使之被泛素化后被26S蛋白酶體降解［12］而失去活性，MDM2具有抗凋亡作用。MDM2已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達明顯升高，是導(dǎo)致野生型p53在惡性腫瘤中表達降低的1個重要原因。Stedk等［13］在研究視網(wǎng)膜母細胞瘤時發(fā)現(xiàn)，在高表達MDM2的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中，進入S期的腫瘤細胞明顯增多，凋亡細胞比例下降;敲除MDM2基因后，腫瘤細胞凋亡比例上升。在以往研究人乳頭瘤病毒(HPV)感染相關(guān)的人宮頸癌細胞時發(fā)現(xiàn)，高危組HPV引起的宮頸癌中，p53蛋白表達水平明顯降低，p53的功能被抑制。這是由于16或18型HPV編碼的癌蛋白E6可促進E3家族成員泛素蛋白連接酶E6-AP(E6-associated protein)和p53蛋白結(jié)合高，使p53蛋白被UPP過度降解［14］;而低危組的E6與p53蛋白則結(jié)合低，很少發(fā)生過度降解，故高危組HPV更易導(dǎo)致宮頸癌。Kelley等［15］研究證明E6蛋白幾乎所有與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的功能均受到E6AP的調(diào)節(jié)。Borbely等［16］發(fā)現(xiàn)HPV16表達的E6蛋白可以通過對p53的泛素化降解，從而激活凋亡抑制基因survivin啟動子并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。

2.2.3 UPP 與 Skp2 Skp2(S-期相關(guān)蛋白 2 S-phase kinase associated protein2)是F-box蛋白家族中成員之一。Skp2基因位于人染色體5p13，分子量約45 kd，能與s期激酶cyclinH-CDK2相互作用。Skp2作為SCF復(fù)合體(Skp1-Cullin-F-Box蛋白復(fù)合體)的底物識別亞基，能夠特異性識別底物并介導(dǎo)其泛素化降解。目前已證明，通過Skp2依賴性泛素-蛋白酶途徑可以降解許多細胞周期調(diào)控蛋白，如p27，p21，Cyclin D1和Cyclin E等等。p27是1種細胞周期蛋白抑制因子，能夠阻滯細胞周期的進展從而抑制細胞的增殖，是1個重要的細胞周期負性調(diào)控因子。Skp2能特異性識別p27，介導(dǎo)其泛素化降解，與腫瘤的形成關(guān)系密切。最近研究顯示，在p27缺失時，CyclinE-Cdk2可增加Skp2的磷酸化，這種磷酸化增加Skp2的自動泛素化，而p27可以抑制Skp2的磷酸化和自動泛素化［17，18］。已有大量的研究表明，在惡性實體腫瘤中p27常呈低表達，Skp2則常呈高表達，且兩者關(guān)系呈負相關(guān)。Sui等［19］用免疫組化法檢測卵巢腫瘤(33例良性和47例惡性)時發(fā)現(xiàn)，在卵巢的惡性腫瘤中Skp2的陽性表達率較良性腫瘤有所增加，且無論是在良性還是惡性卵巢腫瘤中，Skp2和p27之間都呈負相關(guān)。

2.2.4 UPP與抑癌基因VHL VHL基因產(chǎn)物pVHL是E3水解酶的組成成分之一，介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)泛素化降解，可抑制腫瘤間質(zhì)血管的生成。VHL基因突變后，造成HIF表達水平上升，HIF誘導(dǎo)上皮細胞不斷增殖，并利于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。有實驗證明，由于在VHL基因缺陷引起腎細胞癌的裸鼠模型中，被導(dǎo)入VHL后，腫瘤生長受到抑制。Kim等［20］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了含VHL cDNA的腺病毒的腎透明細胞癌細胞株，可被誘導(dǎo)了凋亡，提示VHL與誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡有關(guān)。

3 蛋白酶體抑制劑PS-341

針對泛素-蛋白酶體在腫瘤發(fā)生中的作用機制，國內(nèi)外已對蛋白酶體抑制劑展開研究。根據(jù)蛋白酶體抑制劑與蛋白酶體的活性位點的蘇氨酸殘基反應(yīng)的藥效基團，目前可將其分為5類:醛基肽類、硼酸肽類、乙烯磺基肽類、環(huán)氧酮類和β-內(nèi)酯類。醛肽類是第一類被發(fā)現(xiàn)和廣泛應(yīng)用的蛋白酶體抑制劑，但醛肽類化合物選擇性和穩(wěn)定性較差，易被氧化。硼酸肽類比醛肽類具有更強的蛋白酶體抑制作用，更具選擇性，是比較理想的蛋白酶體抑制劑。其中，硼替佐米(Bortezomib，PS-341)選擇性高，副作用小，是首個被用于臨床的蛋白酶體抑制劑。該藥物已被證明可以通過特異性地抑制細胞內(nèi)26S上糜蛋白酶活性，干擾細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［21］。美國FDA已批準該藥用于治療復(fù)發(fā)性、難治性多發(fā)性骨髓瘤。

在臨床前研究中發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)中的PS-341可以誘導(dǎo)血液系統(tǒng)和實體瘤的惡性腫瘤的凋亡。PS-341通過調(diào)節(jié)前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的穩(wěn)定性，以及抑制NF-κB的活化，誘導(dǎo)細胞凋亡。另有實驗證明PS-341抑制蛋白酶體干擾了未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和增加凋亡。目前認為蛋白酶體抑制劑是1種潛在的抗癌與抗炎藥，通過抑制NF-κB活化可以減少細胞素、酶、細胞黏附分子的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。在對多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌的小鼠模型以及前列腺癌裸鼠移植瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，Bortezomib能明顯抑制腫瘤生長，提高生存率，減少腫瘤新生血管形成［22］。O’Connor等在PS-341的Ⅱ期臨床試驗中，給予淋巴瘤患者PS-341 1.5 mg/m2，結(jié)果顯示患者對PS-341有很好的耐受，PS-341對淋巴瘤患者有顯著的單劑效應(yīng)，整體的反應(yīng)率為58%［23］。

有文獻報道，胞苷脫氨基酶是1種具有抗HIV病毒的酶，而HIV的病毒感染因子加速該酶被UPP通路降解。蛋白酶體抑制劑可以阻斷UPP通路，從而保護胞苷脫氨基酶發(fā)揮抗癌作用。在PS-341的臨床Ⅰ期與Ⅱ期實驗中顯示了卓有成效的抗腫瘤作用和可控制的毒性作用。

隨著人們對腫瘤發(fā)生的分子機制逐漸深入的研究，越來越意識到泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑在腫瘤發(fā)生中的重要性，逐漸把它作為腫瘤治療的主要靶點之一。許多研究表明，很多抑制蛋白酶體活性的藥物可以促進腫瘤細胞凋亡，殺死細胞，克服抗藥性，增強腫瘤細胞對放射治療的敏感性。相信隨著研究的深入，越來越多的蛋白酶體抑制劑將會用于腫瘤的治療中。

［1］ A Ciechanover.Intracellular protein degradation:from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-protea-some system and onto human diseases and drug targeting〔J〕.Cell Death and Differentiation，2005，12(9):1178.

［2］ Chen C，Matesic L E.The Nedd4-like family of E3 ubiquitin ligases and cancer〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2007，26(3 ～4):587.

［3］ Fricke B，Heink S，Steffen J，et al.The proteasomematuration protein POMP facilitates-major steps of20S proteasome formation at the endop lasmic reticulum〔J〕.EMBO Rep，2007，8(12):1170.

［4］ CIECHANOVER A.The ubiquitinp roteolytic system〔J〕.Neurology，2006，66(Suppl 1):S7.

［5］ Meiners S，Ludwig A，Stangl V，et al.Proteasome inhibitors:poisons and remedies〔J〕.Med Res Rev，2008，28(2):309.

［6］ Mukhopadhyay D，Riezman H.Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling〔J〕.Science，2007，315(5809):201.

［7］ Carlos Camp s，Vega Iranzo，RoyM Bremnes，et al.Anorexia-Cachexia syndrome in cancer:implications of the ubiquitin-proteasome pathway〔J〕.Supportive Care in Cancer，2006，14(12):1173.

［8］ Thomas JSayers，William JMurphy.Combining proteasome inhibition with TNF-related apop-tosis-inducing ligand(Apo2L/TRA IL)for cancer therapy〔J〕.Cancer Immunology，Immuno-Therapy，2006，55(1):76.

［9］ Chen ZJ.Ubiquitin signalling in the NF-kappaβpathway〔J〕.Nat Cell Biol，2005，7(8):758.

［10］ Wooff J，Pastushok L，Hanna M，et al.The TRAF 6 RINGfinger domain mediates physical interaction with Ubc13〔J〕.FEBSLett，2004，566(1～3):229.

［11］ Ishii Y，Waxman S，Gwemain D.Targeting the ubiquitin-proteasome pathway in cancer therapy〔J〕.Anticancer AgentsMed Chem，2007，7(3):359.

［12］ Brooks C L，Gu W.p53 ubiquitination:Mdm2 and beyond〔J〕.Mol Cell，2006，21(3):307.

［13］ STEDK P，YING H，CHANGDL，et al.MDM2 promotes proteasomedependent ubiquitin-independent degradation of retinoblastoma pro-tein〔J〕.Mol Cell，2005，20(5):699.

［14］ Stewart D，Ghosh A，MatlashewskiG.Involvementofnuclear export in human papillomavirus type18 E62mediated ubiquitination and degradation of p53〔J〕.JVirol，2005，79(14):8773.

［15］ KELLEY ML，KEIGER KE，LEE CJ，etal.The Global Transcrip tional effects of the human pap-illomavirus E6 protein in cervical carcinoma cell lines aremediated by the E6APubiquitin ligase〔J〕.JVirol，2005，79(6):3737.

［16］ BORBE LY AA，MURVA IM，KO’NYA J，et al.Effects of human pap illomavirus type 16 oncop roteins on survivin gene exp ression〔J〕.JGon Virol，2006，87(Pt2):287.

［17］ Ungermannova D，Gao Y，Liu X.Ubiquitination of p27Kip1 requires physical interaction with cyclin E and probable phosphate recognition by Skp2〔J〕.JBiol Chem，2005，280(34):30301.

［18］ Xu S，Abbasian M，Patel P，et al.Substrate recognition and ubiquitination of SCFSkp2/Cks1 ubiquitin-protein isopeptide ligase〔J〕.J Biol Chem，2007，282(21):15462.

［19］ Sui L，Dong Y，Watanabe Y，et al.Clinical significance of Skp2 expression，alone and combined with Jab1 and p27 in epithelial ovarian tumors〔J〕.Oncol Rep，2006，15(4):765.

［20］ KIM M，YAN Y，LEE K，et al.Ectop ic exp ression of von Hippel-Lindautumor suppressor induces apoptosis in 7862O renal cell carcinoma cells and regresses tumor growth of 7862O cells in nudemouse〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004，320(3):945.

［21］ ADAMS J.The development of proteasome inhibitors as anticancer drug〔J〕.Cancer Cell，2004，5(5):417.

［22］ Milano A，Iaffaioli R V，Caponigro F.The p roteasome:a worth-while target for the treatment of solid tumours〔J〕.Eur JCancer，2007，43(7):1125.

［23］ O’Connor OA，Wright J，Moskowitz C，etal.Phase IIClinical Experience With the Novel Proteasome Inhibitor Bortezomib in Patients With IndolentNon-Hodgkin’s Lymphoma and Mantle Cell Lymphoma〔J〕.Journal of Clinical Oncology，2005，23(4):676.