茜素黃與牛血清白蛋白相互作用特征的熒光光譜法研究

顏承農(nóng) (長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023;長(zhǎng)江大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院,湖北荊州434020)

劉 晶 (中原油田采油工程技術(shù)研究院,河南濮陽(yáng)457001)

劉 義 (武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,湖北武漢430072)

蛋白質(zhì)是生命的最基本物質(zhì)之一,它與營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育、遺傳、新陳代謝等生命活動(dòng)等密切相關(guān),血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白,它能和許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)廣泛結(jié)合。許多藥物、農(nóng)藥和染色劑等有機(jī)小分子都能和蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生相互作用。研究它們與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用特征,探討相互作用的熱力學(xué)性質(zhì)、結(jié)合力性質(zhì)等,可以從分子水平的角度認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)與小分子相互作用的機(jī)理,這對(duì)于促進(jìn)小分子的生物學(xué)效應(yīng)、藥理學(xué)和毒理學(xué)的研究,以及蛋白質(zhì)組學(xué)和生命科學(xué)研究等有著重要的意義[1,2]。有機(jī)小分子染料可以與蛋白質(zhì)結(jié)合,引起染料或蛋白質(zhì)光譜特性的變化,因此小分子染料作為測(cè)定蛋白質(zhì)的探針得到了廣泛應(yīng)用,但它們相互作用的機(jī)理尚在研究探討之中。茜素黃 (Alizarin Yellow R,AYR)是一種穩(wěn)定性比較好的有機(jī)染料,可以作為研究有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)相互作用的熱力學(xué)特征及其對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象影響熒光的探針。下面,筆者掃描了AYR和AYR作用于牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜,分別用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程等處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),得到了相互作用常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)等,為研究AYR的染色機(jī)理,探討釋放到環(huán)境中的AYR產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響等提供重要信息。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1)儀器 LS-55型熒光分光光度計(jì) (美國(guó)PE公司);TU-1901型紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);AY120電子天平 (日本島津公司);恒溫水浴SYC-15型 (南京桑力電子設(shè)備廠)。

2)試劑 AYR儲(chǔ)備液,200μ g/mL;AYR工作液,12μ g/mL;BSA(上海生物化學(xué)制劑廠)溶液,5.0×10-5mol/L;NaCl溶液,0.5mol/L;Tris-HCl緩沖溶液,pH=7.40。所用試劑均為分析純,水為二次去離子水,經(jīng)檢測(cè)均無(wú)熒光雜質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

在10ml比色管中依次加入 2.0ml的NaCl(0.5mol/L)溶液、2.0ml的 Tris-HCL緩沖溶液(pH=7.40)和2.0ml的BSA(5.0×10-5mol/L)溶液及0～3.5ml的AYR溶液,以二次去離子水定容;當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)為285nm、狹縫寬度分別為15nm和2.5nm時(shí),常壓下,分別于21、26、31、36、41℃時(shí),在250～500nm范圍內(nèi)掃描了BSA的熒光猝滅光譜,同時(shí)在26℃時(shí)測(cè)定了體系的同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜,分別獲得試驗(yàn)對(duì)象的相對(duì)熒光強(qiáng)度和吸光度等。

2 AYR對(duì)BSA的熒光猝滅光譜

2.1 熒光猝滅光譜

BSA分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能夠發(fā)射內(nèi)源熒光,當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)為285nm時(shí),BSA熒光發(fā)射峰位置在347nm附近。按試驗(yàn)方法分別掃描了21、26、31、36、41℃等溫度下BSA的熒光發(fā)射光譜和BSA-AYR體系的熒光猝滅光譜,26℃的BSA和BSA-AYR體系的熒光猝滅光譜見圖1。由圖1可以看出,隨著AYR濃度增加,BSA的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律地降低,表明AYR分子能夠與BSA發(fā)生相互作用進(jìn)而猝滅BSA的內(nèi)源性熒光。

圖1 BSA和BSA-AYR體系熒光猝滅光譜

2.2 熒光猝滅作用描述

有機(jī)小分子對(duì)蛋白質(zhì)的熒光猝滅作用可分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移猝滅等。動(dòng)態(tài)猝滅主要是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過(guò)程,不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性,而靜態(tài)猝滅主要是由于小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生了相互作用,可能生成不發(fā)熒光的配合物,影響了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致蛋白質(zhì)生理活性發(fā)生變化。

動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅作用可分別用Stern-Volmer方程:

和Lineweaver-Burk方程:

進(jìn)行描述。式中,IF為有猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度;為無(wú)猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度;cAYR為猝滅劑濃度;KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),它反映了生物大分子與熒光猝滅劑分子彼此擴(kuò)散和相互碰撞到達(dá)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)的量效關(guān)系;Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù),它反映了體系中分子的彼此擴(kuò)散和相互碰撞對(duì)生物大分子熒光壽命衰減速率的影響,各類熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L/(mol·s);τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s;KLB為靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù),單位是mol/L,它反映了在靜態(tài)猝滅過(guò)程中生物大分子與熒光猝滅劑分子相互作用達(dá)到平衡時(shí)的量效關(guān)系[3,4]。

3 熒光猝滅作用性質(zhì)和相互作用力

3.1 熒光猝滅作用性質(zhì)

在溫度分別為 21、26、31、36、41℃時(shí),由試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別作出 BSA的Stern-Volmer曲線和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,如圖2所示。對(duì)數(shù)據(jù)線性擬合得到直線方程、相關(guān)系數(shù)R等見表1。

圖2 Stern-Volmer曲線和Lineweaver-Burk曲線

表1 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

表2 AYR對(duì)BSA作用常量和熱力學(xué)參數(shù)

由AYR對(duì)BSA作用的試驗(yàn)結(jié)果可以看出,Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線的線性關(guān)系明顯優(yōu)于Stern-Volmer曲線的線性關(guān)系;動(dòng)態(tài)猝滅作用的Kq值一般都小于2.0×1010L/(mol·s),但表2中Kq值大于2.0×1010L/(mol·s);相互作用的吉布斯自由能 Δ G小于零,相互作用常量 KLB達(dá)到4.394×104mol/L,說(shuō)明它們之間的相互作用能自發(fā)進(jìn)行,且作用產(chǎn)物穩(wěn)定性良好。BSA、AYR和BSA-AYR體系的紫外-可見吸收光譜如圖3所示。在圖3中,BSA、AYR和BSA-AYR體系的紫外-可見吸收光譜的吸收峰強(qiáng)度和吸收峰位置明顯有別。按照試驗(yàn)方法分別得到 Δλ=60nm 和 Δ λ=15nm 時(shí),BSA和 BSA 與AYR作用的同步熒光光譜,如圖4(a)和4(b)所示 。在 Δλ=60nm和 Δ λ=15nm時(shí)的同步熒光光譜主要分別反映蛋白質(zhì)中Trp和Tyr氨基酸殘基的熒光光譜特征[5]。隨著 AYR濃度的增加,相對(duì)BSA的熒光發(fā)射峰而言,T rp的發(fā)射波長(zhǎng)紅移0.85nm,Tyr的發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移2.0nm。這些都是BSA與AYR相互作用生成一種新復(fù)合物的佐證。

圖3 AYR(1)、BSA(2)和AYR-BSA體系的BSA紫外-可見吸收光譜(3～6)

3.2 相互作用力

有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)相互作用的主要部位是蛋白質(zhì)上的精氨酸、賴氨酸、組氨酸和N端氨基等堿性氨基酸殘基。相互作用力有氫鍵作用力、靜電作用力、疏水作用和范德華力等。Ross等[6]總結(jié)了判斷生物大分子與有機(jī)小分子等作用力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律,即疏水作用力可使體系的ΔH(等壓熱效應(yīng))和ΔS(熵變化)增大,氫鍵力或 Vander Waals力有可能使體系的 ΔH和ΔS減小,靜電作用力使ΔH ≈0,Δ S＞0。

圖4 同步熒光光譜

當(dāng)溫度變化范圍不太大時(shí),反應(yīng)的焓變?chǔ)可以看作是一個(gè)常數(shù)。由Van't Hoff等壓方程的不定積分式:

作圖可以求得ΔH(見圖5),由方程:

可求 Δ Gθ和ΔS等,見表2。相互作用的ΔH ≈0,ΔS＞0,說(shuō)明AYR與BSA之間的作用力可能主要是靜電作用力。這可能是在試驗(yàn)條件下,BSA上的正電性氨基 (—NH3+)把帶負(fù)電荷的茜素黃分子吸引到了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的表面,同時(shí)由于氫鍵等其他非靜電力使兩者結(jié)合的更加緊密。

圖5 ln KLBθ～1/T圖

4 AYR與BSA相互作用的表觀作用常數(shù)KA和作用位點(diǎn)數(shù)n

設(shè)生物大分子B有2個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),與猝滅劑(Q)間的結(jié)合常數(shù)為KA,它們與熒光強(qiáng)度之間符合以下關(guān)系式:

式中,KA為表觀作用常數(shù),斜率為作用位點(diǎn)數(shù)n。作圖,由直線截距可求表觀作用常數(shù)平均值為5.930×105,由斜率可求作用位點(diǎn)數(shù)平均值為1.183。表明BSA與AYR分子可能是1對(duì)1相互結(jié)合為復(fù)合物。

5 AYR對(duì)BSA構(gòu)象的影響

研究證明,三維熒光光譜能提供更多被研究對(duì)象的相關(guān)信息[7]。蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)與外界分子的作用和它們所處環(huán)境的極性等因素有關(guān)。BSA在AYR作用前后的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜和三維熒光光譜的峰強(qiáng)度和峰波長(zhǎng)均有明顯變化。BSA的空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu),幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部,構(gòu)成疏水腔。在水溶液中,BSA主要由疏水作用力維持其空間結(jié)構(gòu)和疏水腔。按照試驗(yàn)方法掃描了BSA和AYR-BSA體系的三維熒光光譜 (見圖6),繪制了等熒光強(qiáng)度圖 (見圖7)。由圖6、圖7可比較AYR作用BSA前后三維熒光光譜的變化,探討AYR對(duì)BSA構(gòu)象和微環(huán)境的影響。AYR作用BSA后,在熒光發(fā)射光譜中BSA的Trp的峰位有明顯紅移,其對(duì)應(yīng)的同步熒光光譜證實(shí)紅移現(xiàn)象(見圖4(a))。而Tyr峰位紅移現(xiàn)象 (見圖4(b))在圖1中是被掩蓋了的。在圖6(a)中,當(dāng)BSA的濃度為1.0×10-5mol/L時(shí),其熒光峰峰頂?shù)南鄬?duì)熒光強(qiáng)度和峰頂坐標(biāo)(IF,λex/λem)為 (492.1,280.0nm/348.5nm),與二維熒光發(fā)射光譜圖一樣,主要描述T rp和Tyr的熒光光譜行為。在圖6(b)中,當(dāng)加入AYR后,BSA的峰頂?shù)南鄬?duì)熒光強(qiáng)度和峰頂坐標(biāo)(IF,λex/λem)為 (283.2,280.0nm/346.0nm),熒光強(qiáng)度降低了208.9,激發(fā)波長(zhǎng)未移動(dòng),但發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移了2.5 nm,說(shuō)明AYR與BSA作用后,部分能量轉(zhuǎn)移到了AYR上,同時(shí)顯示Trp所處微環(huán)境的極性有所削弱,它們盡可能分布在BSA腔內(nèi)的疏水區(qū)內(nèi),而Tyr所處微環(huán)境的極性有所增強(qiáng),可能分布在BSA分子表面附近的親水區(qū)內(nèi),導(dǎo)致BSA形成了一種新的無(wú)序結(jié)構(gòu)。

圖6 BSA和BSA-AYR體系的三維熒光光譜

6 結(jié) 論

1)由21～41℃溫度范圍內(nèi)體系的熒光猝滅光譜數(shù)據(jù),得到了AYR和BSA相互作用的熒光猝滅結(jié)合常數(shù)KLB的平均值為4.394×104mol/L,熱力學(xué)參數(shù)ΔHθ、Δ Gθ和Δ Sθ的平均值分別為-3.408kJ/mol、-27.02kJ/mol和77.64J/K,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的平均值為1.183;熒光猝滅性質(zhì)主要是靜態(tài)猝滅,相互作用力主要是靜電作用力。蛋白質(zhì)分子中的疏水效應(yīng)、各基團(tuán)之間的氫鍵作用和靜電作用力是穩(wěn)定和維持其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要因素。

2)由同步熒光光譜和三維熒光光譜的特征可以看出,AYR作用BSA后,BSA所處微環(huán)境的極性發(fā)生了明顯變化,加上靜電力的作用,肽鏈緊密度增加;非極性的Trp可能更加傾向于分布在BSA分子的疏水部位,而極性的Tyr則更傾向于分布在AYR親水區(qū)內(nèi),這就導(dǎo)致了BSA原有的有序結(jié)構(gòu)破壞,形成了一種新的無(wú)序結(jié)構(gòu)。

圖7 BSA和BSA-AYR體系的等熒光強(qiáng)度圖

3)從所得結(jié)合常數(shù)看,與BSA的結(jié)合常數(shù)達(dá)到104數(shù)量級(jí),且能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象,說(shuō)明AYR也可在哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)運(yùn)載、貯存和積蓄,這也是AYR對(duì)生態(tài)環(huán)境一定負(fù)面效應(yīng)的有力證明[8,9]。

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