大鼠全腦缺血再灌注時(shí)依托咪酯對 BcL-2和相關(guān)因子的關(guān)系

王新程,王進(jìn)全

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)2008級研究生,黑龍江 佳木斯 154003)

依托咪酯(etomidate)作為一種新型的靜脈麻醉藥,靜脈注射后大約1min腦內(nèi)濃度達(dá)到最大,最大效應(yīng)發(fā)生在3min,為快速催眠性靜脈全身麻醉藥。動物研究證明,依托咪酯的作用有部分可通過對腦干網(wǎng)狀系統(tǒng)的抑制和激活作用。對心血管和呼吸系統(tǒng)影響較小,可用于休克或創(chuàng)傷患者的全麻誘導(dǎo),不增加組胺釋放,可降低腦內(nèi)壓、腦血流和眼內(nèi)壓的特點(diǎn)。該藥在不影響平均動脈壓的條件下腦血流和腦氧耗呈劑量依賴性降低,對顱內(nèi)壓降低時(shí)平均動脈壓并不降低,對缺血缺氧性腦損傷有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)就依托咪酯對缺血缺氧性腦損傷時(shí),Bcl-2和相關(guān)因子的關(guān)系展開探討。

1 材料和方法

1.1 材料

Bax兔抗鼠單克隆抗體(SC-526),Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體(SC-492),Caspase-3兔抗人多克隆抗體 (SC-7148),二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑(PV-9001),DAB顯色劑 (ZLI-9018),(TUN EL)原位細(xì)胞凋亡檢測 (ZK-8005)。以上試劑均購于武漢博士的生物科技有限公司。依托咪酯注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

雌性 Wistar大鼠 65只 ,體重 280～ 310g,鼠齡 3～ 4個月 ,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為3組:對照組(C=5),生理鹽水(S=30),依托咪酯組(E=30);生理鹽水組和依托咪組又根據(jù)再灌注的時(shí)間不同分為再灌注1h,6h,12h,24h,48h,72h亞組。

1.3 模型制備

采用大鼠四條血管阻斷方法(Pulsinelli-4VO)[1]制備大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛350mg/kg腹腔注入麻醉后,將大鼠俯臥固定 ,備皮,消毒。在枕骨下于平行脊柱沿頸背正中線切開皮膚,皮下肌肉至第一頸椎,找到后弓上的翼突孔,按其解剖位置將燒灼的細(xì)針直接插入雙側(cè)翼突孔,插入時(shí)間在 2～ 3s即可。并電凝燒閉椎動脈;次日用同樣的麻醉方法處理大鼠后,在頸部正中切口,于雙側(cè)頸動脈鞘出分離雙側(cè)頸動脈,在雙側(cè)頸動脈環(huán)繞絲線并提出頸動脈,用臨時(shí)阻斷夾夾閉頸總動脈造成全腦缺血20min,20min后松開阻斷夾恢復(fù)再灌注。E組于缺血前30min腹腔注入依托咪酯0.3mg/kg,NS組在缺血前30min腹腔注入等溶劑的生理鹽水。C組不電凝雙側(cè)椎動脈,不夾閉雙側(cè)頸總動脈,其余處理與手術(shù)組相同。

于再灌注時(shí)間點(diǎn)麻醉動物,迅速剪開胸腔暴露心臟,于心尖處剪一小口,插入軟管至主動脈,絲線結(jié)扎固定,剪開右心耳快速向心臟推注肝素化生理鹽水,沖凈血液后,以4%多聚甲醛灌流30min,斷頭取腦,由視交叉平面冠狀切取約 4mm組織塊,置4%多聚甲醛固定,脫水,透明,石蠟包埋 ,切片機(jī)做連續(xù)冠狀面切片。

1.4 神經(jīng)功能缺陷評分

[2]評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為評分。0分:正常 ,無神經(jīng)缺陷征象;1分:不能完全伸展右前肢;2分:行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:行走向右側(cè)跌到;4分:不能行走,意識水平下降。累計(jì)1分以上就為模型成功。

1.5 免疫組化及 TUN EL法檢測

免疫組化法檢測 Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白在大鼠海馬 CA1區(qū)的表達(dá)情況。TUN EL法檢測其細(xì)胞的凋亡數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)收集

于 400倍光鏡下計(jì)數(shù) CA1區(qū)細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽性率(陽性率=陽性細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù)×100%)。每張切片計(jì)數(shù)4個不重疊視野,取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表 1。

表1 各組海馬區(qū) Bcl-2,Bax,Caspase-3及 TUN EL陽性細(xì)胞數(shù) (±s)

表1 各組海馬區(qū) Bcl-2,Bax,Caspase-3及 TUN EL陽性細(xì)胞數(shù) (±s)

①BcL-2組間比較:S1V S E1,S2VS E2,S3V S E3,S4V S E4,S5VS E5,S6V S E6(P＜0.05);S1VS S2,S3,S4,S5,S6(P＜0.05);S3,VS S4,S5,S6(P＜ 0.05)。②Bax組間比較:S1VS E1,S2V S E2,S3V S E3,S4V S E4,S5VS E5,S6V S E6(P＜0.05);S1VS S2,S3,S4,S5,S6(P ＜ 0.05);S3V S S4,S5,S6(P ＜ 0.05)。③ Caspase-3組間比較:S1V S E1,S2V S E2,S3V S E3,S4V S E4,S5VS E5,S6V S E6(P＜0.05);S1VS S2,S3,S4,S5,S6(P ＜0.05);S3,VS S4,S5,S6(P＜0.05)。④TUN E組間比較:S1VS E1,S2VS E2,,S3V S E3,S4 V S E4,S5 V S E5,S6 V S E6(P＜0.05);S1 V S S2,S3,S4,S5,S6(P＜0.05);S3 V S S4,S5,S6(P＜0.05)。

組別 BcL-2 Bax Caspase-3 Tunel Bcl-2/Bax S1再灌注 1h 11.17± 0.84 30.44± 0.51 30.47± 0.51 36.34± 0.52 0.37 S2再灌注 6h 20.49± 0.60 36.47± 0.44 36.42± 0.62 40.59± 0.49 0.56 S3再灌注 12h 25.79± 0.69 43.21± 0.47 40.48± 0.55 45.57± 0.53 0.60 S4再灌注 24h 33.25± 0.52 50.40± 0.64 46.57± 0.58 53.02± 0.79 0.66 S5再灌注 48h 39.00± 0.91 55.48± 0.93 51.43± 0.87 59.32± 0.57 0.70 S6再灌注 72h 35.24± 0.53 53.21± 0.46 43.74± 0.80 54.57± 1.04 0.66 E1再灌注 1h 15.32± 0.37 25.36± 0.53 28.44± 0.48 33.22± 0.46 0.60 E2再灌注 6h 25.32± 0.41 20.27± 0.41 23.32± 0.84 29.21± 0.57 1.25 E3再灌注 12h 30.77± 0.37 18.00± 0.67 19.96± 0.17 26.63± 0.57 1.71 E4再灌注 24h 39.62± 0.53 15.44± 0.48 17.47± 0.52 22.24± 0.54 2.57 E5再灌注 48h 45.89± 0.77 13.36± 0.55 14.23± 0.44 18.09± 0.46 3.43 E6再灌注 72h 40.26± 0.46 10.32± 0.57 10.36± 0.51 12.63± 0.46 3.90 F 30.18 31.00 30.24 36.03 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

由于大鼠的腦血管分布非常類似人腦,我們以 Wistar大鼠為研究對象,通過電凝和血管夾阻斷大鼠的供應(yīng)大腦的四條大血管建立起來全腦缺血再灌注模型,于類似全腦缺血再灌注的疾病如心肺復(fù)蘇,器官移植、溶栓術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、低血壓休克等回復(fù)灌流后所引起的病理生理過程,缺血是肯定,符合臨床實(shí)際。細(xì)胞凋亡的概念是由英國病理學(xué)家 Kerr等[3]在1972年提出來用于描述一種在形態(tài)學(xué)有別于細(xì)胞壞死的過程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因的調(diào)控下主動性程序性死亡,受促進(jìn)凋亡基因和抑制凋亡基因的協(xié)調(diào)及雙重調(diào)控。Bax是 Bcl-2家族成員之一。Caspase酶是一種半胱氨酸蛋白激酶,與凋亡啟動和效應(yīng)階段密切相關(guān),Caspase-3是促凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵效應(yīng)酶,又稱殺手蛋白[4];Caspase-9和Caspase-8分別啟動的細(xì)胞內(nèi) /外促凋亡通路都與 Caspase-3。近年來在研究缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn),活化的 Caspase-3可以降解 BcL-2,促使線粒體釋放 Cyto C,進(jìn)而引起細(xì)胞的破壞[5],運(yùn)用 Caspase-3抑制劑可以改善在缺血再灌注損傷中細(xì)胞的損傷和破壞,提示抑制 Caspase酶的活性可以防止缺血再灌注損傷中細(xì)胞的凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。在被實(shí)驗(yàn)中,Bcl-2在 S組和 E組均在回復(fù)灌注 48h到達(dá)高峰 ,而在 E組中,Bcl-2再灌注的時(shí)間增加,表達(dá)也逐漸升高,且一直高于S組 Bcl-2蛋白表達(dá)。Bax和 Caspase-3也都在回復(fù)灌注48h蛋白表達(dá)到達(dá)高峰,隨后降低 ,而在 E組 Bax和 Caspase-3表達(dá)降低。TUN EL在 S組中,48h凋亡達(dá)到在高峰 ,伴隨再灌注時(shí)間的延長,凋亡之間減少;在 E組,凋亡細(xì)胞一直在穗再灌注時(shí)間的增加而緩慢減少。依托咪酯系一種催眠性靜脈全麻藥 ,是咪唑類衍生物,安全性大,對呼吸和循環(huán)影響小,是麻醉誘導(dǎo)常用的藥物之一。綜上所述,在大鼠全腦缺血再灌注損傷過程中,依托咪酯可以促進(jìn)大鼠海馬抗凋亡基因Bch-2的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn) Bch-2蛋白表達(dá),同時(shí)減少 Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)。依托咪酯能在缺血再灌注的組織器官中減少細(xì)胞的凋亡,具體的相互關(guān)系有待進(jìn)一步的研究。

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