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    何首烏飲對(duì)衰老雄性大鼠睪丸生殖功能的影響*

    2010-04-17 14:43:48郭凱華高福祿牛嗣云
    關(guān)鍵詞:何首烏睪酮睪丸

    郭凱華,高福祿,牛嗣云,陳 龍

    (承德醫(yī)學(xué)院,河北承德 067000)

    隨著衰老,睪丸的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)出現(xiàn)不同程度的減退,精子生成能力減弱、血清睪酮水平降低[1-2]。睪酮可促進(jìn)睪丸生精功能,維持性腺的正常結(jié)構(gòu)與功能;睪丸局部調(diào)節(jié)因子IGF-1對(duì)精子發(fā)生也具有調(diào)節(jié)作用。何首烏飲由《宣明論方》何首烏丸加味而成,具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效。本研究給予衰老模型大鼠何首烏飲灌胃,探討其對(duì)衰老雄性大鼠生殖功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 D-半乳糖,北京化學(xué)試劑公司;放射免疫試劑盒,北京北方生物技術(shù)研究所;IGF-1 mRNA原位雜交試劑盒,天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰尽?/p>

    何首烏飲方劑組成:何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓,按質(zhì)量比3:2:3:2:5:3混合,熬制后含生藥為9.6g/ml,4℃保存,給藥前復(fù)溫至25-30℃。何首烏丸方劑組成:何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝,按質(zhì)量比3:2:3混合,熬制后含生藥2.06g/ml,4℃保存,給藥前復(fù)溫至25-30℃。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及建立衰老模型 8周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠32只,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重180-220g。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、何首烏飲組和何首烏丸組,每組8只大鼠。模型組、何首烏飲組和何首烏丸組大鼠均采用6%D-半乳糖(300mg/kg/d,60d)連續(xù)腹腔注射建立亞急性衰老動(dòng)物模型。造模成功后,模型組大鼠不再做處理,何首烏飲組和何首烏丸組大鼠分別給予何首烏飲(38.4g/kg/d)和何首烏丸(8.24g/kg/d)灌胃60天。

    1.3 檢測血清睪酮濃度 各組大鼠灌胃結(jié)束后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,經(jīng)內(nèi)眥取血,離心取上清,采用放射免疫法檢測血清睪酮濃度。

    1.4 精子計(jì)數(shù),觀察精子活動(dòng)度和存活率 各組大鼠取血后,取一側(cè)附睪頭放入盛有5ml生理鹽水并于37℃水浴中預(yù)熱的小培養(yǎng)皿中,剪碎成精子懸液,37℃水浴靜置20min,取0.1ml滴于37℃預(yù)熱的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,光鏡下迅速觀察,記錄200個(gè)精子,計(jì)算精子活動(dòng)度,精子計(jì)數(shù)按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法。取精子懸液1ml,0.4%臺(tái)盼蘭0.1ml染色,光鏡觀察,計(jì)算100個(gè)精子中活精子的比例。

    1.5 睪丸IGF-1 mRNA表達(dá)的檢測及定量分析 大鼠取附睪后,4%多聚甲醛灌流固定,取雙側(cè)睪丸,入含1:1000 DEPC的4%多聚甲醛中固定2h,常規(guī)石蠟包埋,Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片,片厚7μm。采用原位雜交方法觀察睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá),DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。IGF-1雜交探針序列:上游引物5'-GTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTGGCACTC-3',下游引物5'-GAGAGCCAGGTAGAAGAGATGTGAAGACGAC-3'。

    采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,每個(gè)標(biāo)本檢查3張切片,每張切片在10×40倍顯微鏡下檢查10個(gè)視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野IGF-1 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù),計(jì)算免疫陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

    1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠血清睪酮濃度 見附表。模型組大鼠血清睪酮濃度明顯下降,與正常組比較差異顯著(P<0.05);何首烏飲組大鼠血清睪酮濃度明顯高于何首烏丸組和模型組(P<0.05)。

    2.2 大鼠附睪頭精子計(jì)數(shù)、精子存活率和活動(dòng)度 見附表。模型組大鼠精子數(shù)量、存活率和活動(dòng)度均明顯低于正常組(P<0.05);何首烏飲組大鼠精子數(shù)量、存活率和活動(dòng)度明顯高于何首烏丸組和模型組(P<0.05)。

    2.3 大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá) IGF-1 mRNA陽性產(chǎn)物位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和精母細(xì)胞胞漿,呈棕黃色彌散顆粒狀(附圖)。定量分析結(jié)果見附表:模型組大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯低于正常組(P<0.05);何首烏飲組大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯高于何首烏丸組和模型組(P<0.05)。

    附表 大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果(±s)

    附表 大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果(±s)

    與正常組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與何首烏飲組比較:▲P<0.05

    組別 精子相關(guān)指標(biāo)(n=8) 睪酮IGF-1 mRNA數(shù)量(106/ml)存活率(%)活動(dòng)度(%)(ng/ml,n=8) (%)正常對(duì)照組4.62±0.4790.4±4.3181.04±9.954.65±1.1612.42±0.38模型組2.60±0.46*▲46.99±4.73*▲44.8±6.21*▲0.99±0.35*▲ 2.56±0.4*▲何首烏飲組4.45±1.58#78.8±6.65#74.35±9.47#4.01±0.89# 8.99±2.34#何首烏丸組4.11±1.34#65.23±4.36#▲61.33±6.31#▲2.16±1.13*#▲ 5.92±1.01*#▲

    圖 大鼠睪丸IGF-1 mRNA原位雜交染色(×400):1-正常組,2-模型組,3-何首烏丸組,4-何首烏飲組

    3 討論

    D-半乳糖致衰老模型表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的一系列生理生化改變,是目前延緩衰老實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用最多的動(dòng)物模型之一。衰老是機(jī)體正常的生理現(xiàn)象,隨著年齡增長,睪丸呈現(xiàn)退行性變,影響睪酮的分泌和生殖功能。睪丸的生殖功能不僅受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié),同時(shí)也受睪丸局部調(diào)節(jié)因子的影響。

    睪酮是啟動(dòng)和維持精子發(fā)生的重要激素,臨床上常用睪酮水平判斷睪丸的生精功能。睪酮主要通過與支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白結(jié)合維持它在生精小管內(nèi)的高濃度,為生精細(xì)胞的分化提供適宜的內(nèi)環(huán)境。Atantssova等對(duì)精子發(fā)生時(shí)減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的觀察顯示[3],睪酮能直接或間接促進(jìn)生精細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育,抑制生精細(xì)胞凋亡。Chen等報(bào)道[4],在下丘腦、垂體衰老變化的共同作用下,老年男性睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能降低,使睪酮合成和分泌能力下降,導(dǎo)致老年人血清睪酮水平降低。Henkel等發(fā)現(xiàn)[5],附睪精子成熟和精子活動(dòng)力的誘導(dǎo)均需有生物活性的睪酮的作用,因此精子活動(dòng)力下降可能與血清睪酮水平降低有關(guān)。睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞可分泌多種因子,如EGF、IGF-1等,它們對(duì)精子發(fā)生均具有調(diào)節(jié)作用。缺乏IGF-1的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成酶基因表達(dá)水平降低,導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞不能成熟[6]。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞存在IGF-1受體,IGF-1可刺激增強(qiáng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞甾體生成和支持細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白的生成[6]。

    傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎中精氣的盛衰決定衰老的速度,延年益壽中藥均屬補(bǔ)腎類藥。何首烏丸由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝組成,能填精補(bǔ)髓、烏發(fā)延年。何首烏飲于此基礎(chǔ)上加淫羊藿補(bǔ)腎壯陽以強(qiáng)筋骨,丹參活血化瘀以通心脈,茯苓健脾利濕以寧心神,諸藥相配通調(diào)心脾肝腎四臟,而以腎為主。本研究結(jié)果顯示,何首烏飲可以提高衰老大鼠精子數(shù)量、活動(dòng)度和存活率,提高衰老大鼠血清睪酮濃度、上調(diào)睪丸IGF-1mRNA的表達(dá);表明何首烏飲可調(diào)節(jié)雄性大鼠睪丸分泌睪酮的功能,通過提高局部調(diào)節(jié)因子IGF-1 mRNA的表達(dá),改善睪丸的生殖功能,從而延緩性腺衰老。

    [1]Kaufman JM, Vermeulen A. The decline of androgen levels in elderly men and its clinical and therapeutic implications[J]. Endocr Rev, 2005, 26(6):833-876.

    [2]Andersson AM, Jensen TK, Juul A, et al. Secular decline in male testosterone and sex hormone binding globulin serum levels in Danish population surveys[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2007, 92 (12):4696-4705.

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