非組培遺傳轉(zhuǎn)化法在農(nóng)作物上的應(yīng)用

任海紅，任小俊，王 英，劉學(xué)義

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，山西汾陽032200；2.汾陽中學(xué)，山西汾陽032200）

自1983年第1例轉(zhuǎn)基因植株成功獲得以來，植物基因工程研究進(jìn)入了蓬勃發(fā)展時期。轉(zhuǎn)化技術(shù)方法已發(fā)展到20種左右，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、基因槍法、電擊法、PEG法、顯微注射法等，其中最理想的技術(shù)仍是農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)。

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，主要的目的是培育抗病蟲、抗除草劑、抗旱、耐鹽堿的優(yōu)質(zhì)農(nóng)作物新品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破了物種的界限，可以將動物、微生物的有益基因轉(zhuǎn)化到植物中。目前，已有一系列轉(zhuǎn)基因作物品種形成，如抗蟲棉、抗蟲玉米、抗蟲水稻、抗除草劑大豆、抗白葉枯病水稻等。植物基因工程技術(shù)在農(nóng)作物品種改良和育種方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化所采用的受體系統(tǒng)，大都依賴于細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)才能獲得轉(zhuǎn)基因植株。但由于組培周期長并存在一定的局限性，因而近年來發(fā)展起來一些非組培的轉(zhuǎn)化方法。本文著重對幾種非組培轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)原理及其在農(nóng)作物上的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，并對今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 幾種非組培轉(zhuǎn)化方法的原理及其應(yīng)用

1.1 真空滲透法

真空滲透法是一種原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化方法。1993年，Bechtold等首先在擬南芥的轉(zhuǎn)化中獲得成功。該方法主要步驟為:在開花早期將擬南芥花浸入含農(nóng)桿菌菌液的液體培養(yǎng)基中，然后用真空泵抽真空處理，再恢復(fù)常壓，使農(nóng)桿菌菌液滲入到植物組織內(nèi)部。真空處理之后植株處于一種極度衰弱的狀態(tài)，需平放于高濕環(huán)境中進(jìn)行恢復(fù)性生長，然后轉(zhuǎn)栽于正常生長條件下，收獲種子，篩選、檢測轉(zhuǎn)基因植株。

Bechtold等建立了整株（in planta）原位真空滲入遺傳轉(zhuǎn)化方法，此后許多學(xué)者在擬南芥[1]和蕓薹屬的一些作物[2]上進(jìn)行了大膽嘗試。李曉等[3]以棉花花粉作為受體細(xì)胞，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下將外源基因?qū)牖ǚ壑?，然后通過人工授粉獲得轉(zhuǎn)化。它避開了傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法所需的組培過程，含外源基因的花粉可與卵細(xì)胞自然結(jié)合，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體不存在轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞間的嵌合現(xiàn)象。

真空滲透法轉(zhuǎn)化植物不需經(jīng)過組織培養(yǎng)即可直接獲得轉(zhuǎn)化的種子，易于重復(fù)，可靠性高。目前，真空滲透法在擬南芥、白菜、油菜等的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較多[4-5]。實(shí)驗(yàn)中，植物發(fā)育階段、抽真空的強(qiáng)度和時間、農(nóng)桿菌的濃度對轉(zhuǎn)化效率都有影響。

1.2 Floral-dip法

Floral-dip法是在擬南芥真空滲透法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。在植株的花蕾期，將花序浸漬在含有表面活性劑的工程農(nóng)桿菌菌液中，經(jīng)表面活性劑的吸附和滲透作用，強(qiáng)化和刺激細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

Clough等[6]首先在擬南芥中用浸蘸法轉(zhuǎn)化獲得成功。后來，Chung等[7]對擬南芥花序進(jìn)行了農(nóng)桿菌菌液直接噴霧（floral-spray）處理，同樣獲得了轉(zhuǎn)化株，這是比Floral-dip法更為簡便的轉(zhuǎn)基因方法。在作物方面，劉琦[8]用此方法將CYCD2基因?qū)胄←溨?，進(jìn)行了有意義的嘗試。暢乃迪[9]嘗試采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Floral-dip轉(zhuǎn)化法，在大田中首次對玉米雄花進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了成功。王翠艷等[10]首次運(yùn)用Floral-dip法將植酸酶基因轉(zhuǎn)入冀豆12，獲得遺傳轉(zhuǎn)化率為1.18%～2.22%。雖然此方法在作物方面的應(yīng)用并不是很成熟，但這些大膽的嘗試對擴(kuò)展該方法的應(yīng)用領(lǐng)域、簡便有效地提高作物的遺傳轉(zhuǎn)化效率奠定了一定的基礎(chǔ)。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法是一種建立在不依賴于植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，是周光宇等[11]在20世紀(jì)80年代建立的。該技術(shù)利用開花植物授粉后形成花粉管通道，使得外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，直接將外源DNA導(dǎo)入尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。該方法可用于任何開花植物。據(jù)操作方式的不同，它通常有2種方法，即子房注射法和柱頭滴注法。

子房注射法是指使用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房中，由于子房產(chǎn)生的高壓力及卵細(xì)胞的吸收，使外源基因進(jìn)入受精的卵細(xì)胞。劉博林等[12]采用合子期子房微注射法，將龍葵Atrazine抗性基因psbA導(dǎo)入對Atrazine敏感的大豆葉綠體基因組中，經(jīng)直接用Atrazine涂抹葉片及葉片在較強(qiáng)光誘導(dǎo)下熒光動力學(xué)研究和間接分子雜交試驗(yàn)等檢測方法鑒定，獲得了轉(zhuǎn)基因大豆植株。張國棟等[13]將玉米自交系和大豆品種東農(nóng)36的DNA分別導(dǎo)入另一大豆品種中，其后代的突變率分別為10%和5.32%，出現(xiàn)了種子蛋白含量、株高、莖粗、結(jié)莢習(xí)性、倒伏性、每株分枝數(shù)與莢數(shù)、粒數(shù)與百粒質(zhì)量等性狀變異。余桂榮等[14]選擇開花后0.5～2.0 h的小麥作受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得較高的結(jié)實(shí)率和轉(zhuǎn)化率。李余良等[15]用子房注射法將Bt抗蟲基因?qū)氤鹩衩灼贩N粵甜3號，獲得了1株整合有Bt基因的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為9.09%。李遠(yuǎn)新等[16]以黃瓜品種津研4號為受體，以質(zhì)粒pBI121為供體，建立起高效的黃瓜子房注射轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，試驗(yàn)表明，黃瓜授粉后12 h注入外源基因的轉(zhuǎn)化率最高。魏愛民等[17]也用子房注射法得到抗蟲轉(zhuǎn)基因苗。田間子房注射轉(zhuǎn)化法主要用于子房較大的作物，如棉花、玉米、瓜類。由于該方法轉(zhuǎn)化偶然性比較大，因此，成功的關(guān)鍵是注射時間及注射位置和深度的把握。

柱頭滴注法是先將正在大量授粉的花柱柱頭切去，然后滴入DNA（DNA的濃度要大于子房注射法）。周春江等[18]利用柱頭滴注法將兔防御素NP-1基因?qū)胄←溨校?jīng)田間抗病蟲鑒定，這些植株對于白粉病、葉銹病和條銹病有較強(qiáng)的免疫力和抗性。王永芳等[19]采用柱頭滴注法將谷子的抗逆相關(guān)基因DNAj轉(zhuǎn)入小麥中，獲得了成功，為創(chuàng)造抗逆性改良的小麥新材料奠定了基礎(chǔ)。在大豆方面，雷勃鈞等[20]將半野生大豆的總DNA導(dǎo)入到栽培大豆中，育成我國第1個利用花粉管通道法獲得的大豆品種黑生101。2006年，劉德璞等[21]以吉林20號、吉林30號、吉林45號為供試材料，通過花粉管通道法，將雪花蓮凝集素GNA基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過接蚜鑒定和PCR檢測，從中篩選出轉(zhuǎn)基因植株，后代分離符合孟德爾規(guī)律，轉(zhuǎn)化率約為1%。劉建鳳[22]在花粉管通道法的基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化了大豆柱頭滴注法。其具體做法為：選取大豆自花授粉6～8 h后的完全開放的花朵，首先用鑷子去除同一節(jié)上不符合要求的花，然后將符合要求的花用鑷子夾去花瓣，接著用剪刀完全剪去花柱，將6 μL轉(zhuǎn)化溶液滴加在子房傷口處，如氣溫較高，補(bǔ)滴1次，轉(zhuǎn)化率可達(dá)3.18%。趙寶存等[23]在小麥?zhǔn)诜酆?～4 h，用剪刀剪去柱頭的1/3，將T型細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系75-23369B線粒體的基因文庫的不同重組子DNA滴在斷面上。結(jié)果顯示，重組子ME252和ME317的轉(zhuǎn)化后代變成可育。張森燕等[24]將構(gòu)建好的ZmPti1基因的正義表達(dá)載體和RNAi載體，通過柱頭滴注法分別轉(zhuǎn)化到玉米自交系178中。經(jīng)檢測分別得到15株和18株轉(zhuǎn)基因植株。此法適用于較小花器的作物。

實(shí)際操作中，作物所采用的轉(zhuǎn)化方式，注入DNA溶液的量均根據(jù)子房的大小而定。除了應(yīng)考慮導(dǎo)入方式對花器（子房、柱頭）傷害最小外，導(dǎo)入時間和時期的選擇也至關(guān)重要。對于有些植物開花授粉時間不易控制的，可以先進(jìn)行人工授粉，再在一定的時間梯度內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理。

1.4 胚性組織浸染轉(zhuǎn)化法

近年來發(fā)展起來一種浸染轉(zhuǎn)化法，不同的研究單位方法不同。其原理是根據(jù)種子的發(fā)芽生理，將外源DNA隨著種子或幼胚的萌發(fā)或生長，進(jìn)入種胚細(xì)胞，在當(dāng)代就能表現(xiàn)出變異，并得到遺傳。

Rohini等[25]將種子中的一個子葉去掉，把帶有胚軸的另一片子葉萌發(fā)后用無菌針在胚軸處輕輕劃幾下，在農(nóng)桿菌中浸泡幾分鐘，然后共培養(yǎng)、漂洗，子葉繼續(xù)萌發(fā)、生苗，收獲種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后代的檢測。Rohini等[26]用該方法在花生上獲得成功，轉(zhuǎn)化效率達(dá)3.3%～5.3%。王成杰[27]初步建立了利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥萌芽種子的方法，并證明外源基因已轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。山西省農(nóng)科院孫毅等發(fā)明了以萌動胚為受體的轉(zhuǎn)化方法，梁雪蓮等[28]用此方法與花粉介導(dǎo)、子房注射法在玉米上轉(zhuǎn)化bar基因，從轉(zhuǎn)化率與操作簡便程度上進(jìn)行比較，認(rèn)為花粉介導(dǎo)優(yōu)于萌動種胚法，且二者又優(yōu)于子房注射法。王昌濤等[29]成功地建立了一個農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系，具體做法為：把劃好的玉米萌動胚放入YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min振蕩24 h，然后把種子放在MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入帶有潮霉素的篩選培養(yǎng)基中7～10 d，經(jīng)過篩選后的幼苗移栽到溫室中。

胚性組織浸染轉(zhuǎn)化法克服了組織培養(yǎng)再生難、轉(zhuǎn)化率低的缺點(diǎn)，不需要高昂的儀器設(shè)備，是高頻、簡單、快捷的非組培遺傳轉(zhuǎn)化途徑，便于一般科研院所推廣應(yīng)用。但該技術(shù)還需要在實(shí)踐中不斷完善。

2 問題及展望

本文所述的植物非組培轉(zhuǎn)化方法具有簡便、快捷、無需組培等優(yōu)點(diǎn)，但這些方法有的還處于嘗試階段，在作物上應(yīng)用還不成熟，轉(zhuǎn)化效率還很低，不能滿足作物育種和功能基因研究的需要。因此，對非組培轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化過程中的影響因素仍需進(jìn)一步研究。目前，花粉管通道法相對成熟，且易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)?；蜣D(zhuǎn)化，是一種很有潛力的作物遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前，花粉管通道法在我國已成為與農(nóng)作物育種應(yīng)用結(jié)合最為密切的技術(shù)，是安全高效的分子育種途徑，是生物技術(shù)育種中的一個重要研究領(lǐng)域。

隨著分子生物學(xué)和植物基因工程的不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為手段的植物遺傳改良成為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種的重要途徑。而轉(zhuǎn)基因作物的安全性越來越受到人們的重視，其中，篩選標(biāo)記基因和載體骨架序列是影響轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的重要因素?；驑尯娃r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目前均較難實(shí)現(xiàn)無載體骨架序列無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化，而花粉管通道法等非組培方法可以解決該問題。因此，隨著非組培轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)、轉(zhuǎn)化效率的提高，植物非組培轉(zhuǎn)化方法將為作物分子育種和基因功能研究提供有力的方法保障。

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