三種多糖對抗人紅細(xì)胞 A、B抗原單克隆抗體穩(wěn)定性的影響

張坤娟,鄧郁青,弋國紅,張紅中*,王從印,張雪迎,王惠芬

(1河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心,石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所)

抗 A、抗 B血型定型試劑是 ABO血型鑒定的必需試劑。目前臨床使用的均為單克隆抗體(以下簡稱單抗)血型試劑,其優(yōu)點(diǎn)為生產(chǎn)成本低、節(jié)約血資源、特異性高、親合力好、操作簡單方便,但穩(wěn)定性欠佳,主要表現(xiàn)為鄰近效期,抗體效價下降。已有文獻(xiàn)報道,海藻糖對單抗的熱穩(wěn)定性具有保護(hù)性作用[1]。2002～2005年,我們觀察了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對抗人紅細(xì)胞 A、B抗原腹水型單抗穩(wěn)定性的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 三株抗人紅細(xì)胞 A抗原雜交瘤細(xì)胞和三株抗人紅細(xì)胞 B抗原雜交瘤細(xì)胞,均分泌 IgM型抗紅細(xì)胞抗原單抗,由河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心提供。將 1×105個雜交瘤細(xì)胞注入 BABL/c小鼠腹腔,7～10 d后可見腹腔有腹水產(chǎn)生,用注射器針頭抽取腹水,制備抗人紅細(xì)胞 A、B抗原腹水型單抗備用。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖均購自北京化工廠,分析純。人 A、B、O型紅細(xì)胞購自上海血液生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含多糖抗體稀釋溶液的制備 定量稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖,加入生理鹽水中制備成葡萄糖、蔗糖、麥芽糖穩(wěn)定溶液。將三株抗人紅細(xì)胞 A抗原單抗腹水和三株抗 B抗原單抗腹水分別等比例混合后,按 6%體積比加入至 3組多糖溶液中,并加入終濃度為 1∶2 000的疊氮鈉防腐,制備成抗紅細(xì)胞抗原的單抗含糖稀釋溶液。

1.2.2 抗人紅細(xì)胞 A、B抗體效價測定 將待測腹水抗體溶液用生理鹽水進(jìn)行 2倍連續(xù)稀釋,0.2 ml/管,稀釋至第 10管,第 11管做生理鹽水對照,加入等量相應(yīng)血型的 2%紅細(xì)胞懸液振蕩混勻,室溫放置 15m in,1 000 r/min離心 1 min后觀察結(jié)果,以產(chǎn)生“+”凝集的待檢液最高稀釋度計算效價。

1.2.3 三種多糖有效穩(wěn)定濃度的確定 將已制備的含不同濃度糖的單抗稀釋溶液放置 56℃、30 min,并測定加熱前后抗體效價,確定有效穩(wěn)定濃度。結(jié)果置 56℃、30min后,抗 A鹽水組抗體效價滴度下降明顯,抗 B鹽水組抗體已測不出凝集效價,0.1～0.8mol/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖溶液對單抗效價均有一定穩(wěn)定作用,同一種多糖高濃度的穩(wěn)定效果優(yōu)于低濃度,蔗糖和麥芽糖穩(wěn)定作用優(yōu)于葡萄糖,三種多糖的最佳有效穩(wěn)定濃度為 0.4mol/L。

1.2.4 三種多糖對抗人紅細(xì)胞單抗抗體效價的影響 根據(jù) 1.2.3有效穩(wěn)定濃度的初篩結(jié)果,按1.2.1分別制備濃度為 0.4 mol/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖紅細(xì)胞單抗稀釋溶液,分別計為葡萄糖組、蔗糖組、麥芽糖組,同法制備生理鹽水對照(鹽水組)單抗稀釋溶液,均置 37℃、室溫、4℃三種溫度條件存放,定期監(jiān)測抗體效價變化,監(jiān)測時間間隔分別為 1周(共 8周)、4周(共 6個月)和 3個月(共 24個月)。

2 結(jié)果

37℃、2周時,葡萄糖、蔗糖、麥芽糖組抗體效價均未降低,鹽水組抗 A效價由放置前的 1∶512降至1∶128、抗 B效價由 1∶256降至 1∶64。 4周時 ,三種多糖組抗 A效價仍未降低,抗 B效價蔗糖組未降低、葡萄糖和麥芽糖組降低了 1個稀釋度;抗 A效價鹽水組則降為 1∶64、抗 B降為 1∶8。 8周時,鹽水組已測不出凝集效價,抗 A、抗 B效價蔗糖組分別下降了 1和 2個稀釋度、葡萄糖和麥芽糖組下降了 2和 3個稀釋度。室溫、4個月時,三種多糖組抗體效價保持不降,鹽水組抗 A效價降至 1∶64、抗 B降至1∶32。6個月時,抗 A效價鹽水組降至 1∶4,蔗糖和麥芽糖組未降,葡萄糖組下降了 1個稀釋度;抗 B效價鹽水組已檢測不出陽性結(jié)果,蔗糖組下降了 1個稀釋度,麥芽糖和葡萄糖組效價分別下降了 2和3個稀釋度。4℃時鹽水組抗 A、抗 B效價 6個月時均未降低,12個月時均下降 1個稀釋度,18個月時下降 3個稀釋度,24個月抗 A降至 1∶16、抗 B降至1∶4;而各多糖組抗 A、抗 B效價保存至 24個月時仍保持不變。

3 討論

正確測定和判讀受血者和獻(xiàn)血者的血型是臨床輸血的關(guān)鍵,而具有穩(wěn)定可靠質(zhì)量的血型定型試劑是保證正確測定的前提。目前,臨床常用的國內(nèi)單抗血型定型試劑與進(jìn)口試劑相比在穩(wěn)定性等方面還存在一定差距,主要表現(xiàn)為隨儲存時間的延長或非冷鏈運(yùn)輸?shù)仍?血型試劑效價有不同程度地下降,凝集強(qiáng)度變?nèi)?對于一些抗原性較弱的血樣,可能發(fā)生血型的錯誤判讀[3,4]。

解決血型單抗試劑長期保存穩(wěn)定性降低的方法主要有兩種,一是增加試劑中抗體的含量,提高血型單抗初始效價;另一種是加入適量的抗體蛋白穩(wěn)定劑,如一定量的小鼠腹水、腹水提取蛋白或酪蛋白等。前一種方法需要消耗大量的人力物力,增加試劑的成本,而加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑則更為方便實用。本研究結(jié)果顯示,不同血型抗體的穩(wěn)定性存在差異,放置溫度對血型試劑的效價有很大影響,0.1～0.8 mol/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對抗 A、B單抗均有一定的穩(wěn)定作用,高濃度穩(wěn)定效果優(yōu)于低濃度,三種多糖中以蔗糖穩(wěn)定作用最好。以 0.4 mol/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為穩(wěn)定劑,在 37℃下腹水單抗的效價可延長至 2～3周;在室溫條件下,效價可延長至4～6個月;在 4℃下,效價可延長至 24個月。

綜上所述,臨床血型試劑不宜在較高溫度條件下長時間放置,平時應(yīng) 4℃保存。采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖(尤其是蔗糖)作為穩(wěn)定劑,可明顯提高單抗的穩(wěn)定性,有效延長抗體的使用期限,降低生產(chǎn)成本。

[1]計融,江濤,李業(yè)鵬,等.海藻糖對單克隆抗體熱穩(wěn)定性保護(hù)作用的研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2001,13(2):10-12.

[2]中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會.中國生物制品規(guī)程 [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:601-604.

[3]黃麗雅,陳勇高,周越勤,等.抗 A和抗 B血型定型試劑穩(wěn)定性觀察及對亞型檢測的影響[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2007,22(6):20-23.

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