骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展*

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院骨科(宜昌 443002)嚴(yán)雪港 綜述 鮑同柱 審校

隨著社會(huì)人口老齡化 ,骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)發(fā)病率越來越高,已成為50歲以上男性無法參加工作的第二位原因,僅次于缺血性心臟病[1]。O A的主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性降解,以往研究大多側(cè)重于基質(zhì)酶性降解和 /或合成新的基質(zhì)受到抑制而導(dǎo)致軟骨的破壞,很少注重軟骨細(xì)胞生存或死亡在O A關(guān)節(jié)軟骨降解過程中所起的作用。近年來研究顯示,正常的軟骨細(xì)胞是維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的必要條件,細(xì)胞凋亡是OA關(guān)節(jié)軟骨退變的關(guān)鍵因素[2]。現(xiàn)就軟骨細(xì)胞凋亡與O A的關(guān)系作一綜述。

1 細(xì)胞凋亡 1965年,澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)結(jié)扎鼠門靜脈后,電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞,這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集 ,但溶酶體并未被破壞,不同于細(xì)胞壞死。1972年,Kerr等[3]首先提出了細(xì)胞凋亡(Apoptosis)的概念,其主要特點(diǎn)是細(xì)胞核特征性裂解,但細(xì)胞器保持完整 ,因細(xì)胞死亡過程中無內(nèi)容物的暴露,所以幾乎不導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的、主動(dòng)地去除非需要或損傷細(xì)胞的程序性死亡過程,與生長、發(fā)育以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定密切相關(guān)。然而,異常凋亡則是病理性和有害的 ,腫瘤、Alzheimer's病、獲得性免疫缺陷綜合征等多種疾病均與細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)。

2 OA軟骨細(xì)胞凋亡及特點(diǎn) Hashimoto[4]用流式細(xì)胞技術(shù)檢測到 OA軟骨細(xì)胞22.3%發(fā)生凋亡,而正常軟骨細(xì)胞為4.8%。 Heraud等[5]采用熒光激活細(xì)胞分類法(FACS)、原位雜交及脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)等方法觀察人正常和 OA股骨頭關(guān)節(jié)軟骨,發(fā)現(xiàn) OA患者中有 18%～ 21%軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡特征,而正常關(guān)節(jié)軟骨中只有2%～5%凋亡細(xì)胞。國內(nèi)學(xué)者秦泗通等[6]通過對(duì)大鼠行單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除術(shù)(ACL T)造模后與正常組比較,凋亡指數(shù)分別為(11.31±1.34)%和(1.48±0.38)%。綜上所述,盡管軟骨細(xì)胞的凋亡比例各家報(bào)道略有差別(差異可能與檢測方法或?qū)嶒?yàn)對(duì)象不同有關(guān)),但均證實(shí)了O A關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡高于正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

與一般細(xì)胞凋亡相比,OA軟骨細(xì)胞凋亡有其獨(dú)特性:①將關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)泡分離出來連同正常的軟骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞誘生的凋亡小體進(jìn)行三磷酸核苷酸磷酸脫氫酶(N TPPH)的活性檢測,發(fā)現(xiàn)N TPPH在軟骨細(xì)胞間隙內(nèi)或軟骨基質(zhì)間凋亡小體內(nèi)的活性明顯升高,由于 NTPPH與鈣化沉積和骨的鈣化有關(guān),因此凋亡小體可能有加速關(guān)節(jié)軟骨鈣化的功能[7];②由于關(guān)節(jié)軟骨中無血管分布,當(dāng)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),凋亡小體無法被巨噬細(xì)胞帶走而滯留在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi),影響關(guān)節(jié)軟骨正常生理功能,只有當(dāng)軟骨基質(zhì)發(fā)生降解,凋亡小體才有可能被釋放到關(guān)節(jié)間隙中而被清除;③軟骨細(xì)胞凋亡與基質(zhì)降解密切相關(guān)[8],當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度凋亡時(shí),由軟骨細(xì)胞合成的基質(zhì)減少,破壞其生存環(huán)境,形成惡性循環(huán)。上述特點(diǎn)闡明了軟骨細(xì)胞凋亡在O A的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

3 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡途徑 Hashimoto[9]研究發(fā)現(xiàn),OA軟骨細(xì)胞凋亡由NO和 Fas兩種途徑介導(dǎo),因NO合成的抑制劑不能抑制 Fas途徑誘導(dǎo)的凋亡,兩者相互獨(dú)立。

3.1 NO途徑:一氧化氮(Nitric oxide,NO)是 80年代被發(fā)現(xiàn)的一種具有高度反應(yīng)性、細(xì)胞毒性、彌散性物質(zhì),對(duì)細(xì)菌、真菌和腫瘤細(xì)胞及正常組織均能產(chǎn)生殺傷作用的無機(jī)小分子,廣泛存在于生物體內(nèi)。 Kaur等[10]證實(shí)NO對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)損傷通過兩種途徑起作用:其一為高濃度的 NO能抑制多種與線粒體電荷傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶;其二為NO與超氧化陰離子O2-反應(yīng)生成過氧化亞硝基陰離子ONOO-,在一定條件下分解為有很強(qiáng)毒性的OH-和NO-自由基。OA是由一系列生物與力學(xué)因素引起的退行性疾病,其軟骨細(xì)胞能產(chǎn)生 IL-1、TNF-α、前列腺素和NO等大量炎性調(diào)節(jié)因子[11]。Wu等[12]和 Maneiro等[13]研究發(fā)現(xiàn),無論是內(nèi)源性的或外源性NO,均能通過線粒體途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞調(diào)亡,將人軟骨細(xì)胞通過NO外源性供體硝普鈉(SNP)或內(nèi)源性供體磷酸脂多糖(LPS)和干擾素(INF)-γ、NO、活性氧(ROS)、細(xì)胞色素 C干預(yù)后,均導(dǎo)致 Caspases-3活性升高和DN A裂解,用NO合酶抑制劑L-單甲基精氨酸治療O A則能降低NO及其它細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá),有力地證明了 NO可誘導(dǎo) OA軟骨細(xì)胞凋亡。

3.2 Fas途徑:Fas是位于細(xì)胞膜上Ⅰ型跨膜糖蛋白,又稱 Apo-1或 CD95,屬 TN F/NGF受體家族成員 ,是一條公認(rèn)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路,許多細(xì)胞表達(dá) Fas,人類 Fas基因位于第 10號(hào)染色體,FasL是Ⅱ型膜蛋白,屬腫瘤壞死因子家族成員,僅在激活的 T淋巴細(xì)胞表達(dá),位于第 1號(hào)染色體。當(dāng) Fas與Fas-L結(jié)合后,誘導(dǎo)酪氨酸和蘇 /絲氨酸發(fā)生磷酸化反應(yīng),引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,從而活化 Caspase,引起 DN A降解,導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡[14]。正常人的軟骨幾乎看不到凋亡細(xì)胞,而在OA患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū),Fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,OA受損區(qū)的 Fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū)[15],提示Fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)鳥苷能增強(qiáng)Fas-Fasl的相互作用,從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步佐證了 Fas途徑與軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。 Hashimoto[9]等研究發(fā)現(xiàn),Fas可在軟骨細(xì)胞表達(dá),Fas-L主要由滑膜中激活的 T細(xì)胞產(chǎn)生,而軟骨細(xì)胞不能表達(dá),因此 Fas途徑是與滑膜炎癥相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑。

4 OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)原癌基因的表達(dá) 軟骨細(xì)胞的存活依賴于癌基因之間的平衡,Bcl-2基因家族、P53基因、ICE基因家族、c-myc基因等均可調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡途徑,其中 Bcl-2基因家族和P53基因研究較為深入。

4.1 Bcl-2基因家族:Bcl-2基因是 1984年由 Tsujimto等在濾泡性淋巴瘤細(xì)胞中染色體易位 t(14:18)的斷點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,位于18號(hào)染色體短臂,Bax基因是Bcl-2基因家族的最主要的促凋亡基因,定位于11號(hào)染色體。該基因家族通過以下途徑來調(diào)控細(xì)胞凋亡[17]:① Bax和 Bcl-2、Bcl-X1可形成脂質(zhì)雙分子層通道,Bax促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放,形成正反饋擴(kuò)大過程,導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的紊亂 ,線粒體外基質(zhì)內(nèi)流,滲透壓失衡,細(xì)胞器腫脹,線粒體的內(nèi)、外膜依次裂解,釋放出Caspase,激活蛋白 ,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而Bcl-2、Bcl-X1抑制 PTP開放,阻止細(xì)胞凋亡;② Bcl-2直接或間接阻止細(xì)胞色素 C(CytC)從線粒體釋放,抑制細(xì)胞凋亡;③Bax同源二聚體能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,隨著 Bcl-2蛋白表達(dá)量上升,越來越多的Bax二聚體分開,與 Bcl-2形成比 Bax-Bax更穩(wěn)定的 Bax-Bcl-2異源二聚體,從而“中和”了 Bax-Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用;④定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Bcl-2可能通過阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的流動(dòng),使依賴 Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低,從而阻斷細(xì)胞凋亡;⑤Bcl-2通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能。Hashimoto[5]認(rèn)為 OA患者軟骨細(xì)胞中BaxmRNA的升高是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的重要因素,而 Bcl-2mRNA表達(dá)的升高,則是機(jī)體保護(hù)軟骨細(xì)胞免遭凋亡的體現(xiàn)。國內(nèi)學(xué)者馬春輝[18]對(duì)原發(fā)性 OA、繼發(fā)性O(shè)A和正常關(guān)節(jié)軟骨通過逆轉(zhuǎn)錄 /聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 Bax/Bcl-2 mRNA,發(fā)現(xiàn)原發(fā)性 OA中 BaxmRN A和 Bcl-2mRN A均升高,而繼發(fā)性 OA中只有 Bcl-2mRN A升高,結(jié)果與Hashimoto的觀點(diǎn)一致。

4.2 P53基因:P53基因于 1979發(fā)現(xiàn),人類 P53基因定位于17號(hào)染色體短臂(17P13.1),由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成,編碼分子量為 53-kDa的核內(nèi)磷酸化蛋白,以轉(zhuǎn)錄因子的形式控制細(xì)胞增殖與 DN A修復(fù)[19]。 P53通過感知細(xì)胞 DN A損傷,靶基因編碼產(chǎn)物 P21可以促使細(xì)胞停留在 G1期,進(jìn)行 DNA損傷修復(fù),一旦這種修復(fù)無法完成,P53將促進(jìn)一系列凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) ,例如 Bax、 PUMA、Noxa、Fas、P53調(diào)控的凋亡誘導(dǎo)蛋白 1(P53-regulatedapoptosisinducingprotein1,P53AIP1),從而有效的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。 Okazaki等[21]檢測兔 P53mRNA水平、TUN EL檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)兔膝 OA組中明顯高于正常組,從而提示 P53在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。有證據(jù)顯示[19],P53基因能分別誘導(dǎo) Bax基因表達(dá),抑制Bcl-2基因表達(dá),提示 P53基因與 Bcl-2基因家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡時(shí)具有協(xié)同作用。

5 結(jié) 語 軟骨細(xì)胞凋亡途徑受到包括 Bcl-2基因家族和 P53基因在內(nèi)的許多因素調(diào)控,通過對(duì)凋亡過程中胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與級(jí)聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵步驟的研究深入,利用藥物切斷其信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制軟骨細(xì)胞凋亡,已成為目前研究重點(diǎn)。

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