血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、微血管密度和促紅細(xì)胞生成素在子宮腺肌病中的作用探討

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710032)

劉朵朵 王寶玲*

子宮腺肌病(Adenomyosis,AMS)與腫瘤一樣依賴于血管生成(Angiogenesis),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種關(guān)鍵的促血管生成因子,微血管密度(Microvascular density,MVD)則是反映血管生成的定量指標(biāo),促紅細(xì)胞生成素(Erythmpoietin,EPO)是參與調(diào)控血管生成的血管生長(zhǎng)因子,廣泛地參與了多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡等各種生理和病理過程。本研究觀察V EGF、MVD及EPO在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜中的表達(dá),以探討其在該疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

1 材料選擇 隨機(jī)抽取 2004～2008年陜西省婦幼保健院收治的子宮腺肌病患者行開腹或腹腔鏡手術(shù)取異位內(nèi)膜標(biāo)本 40例作為研究組,患者年齡 23～46歲,其中增生期21例,分泌期19例。同期隨機(jī)抽取因各種良性疾病行開腹或腹腔鏡手術(shù)取子宮內(nèi)膜標(biāo)本 39例作為對(duì)照組,患者年齡24～49歲,其中增生期20例,分泌期19例。兩組標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí),且在年齡、內(nèi)膜分期方面的差別比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),術(shù)前6個(gè)月均未使用過激素類藥物和未放置宮內(nèi)節(jié)育器。

2 方 法

2.1 取材:實(shí)驗(yàn)組手術(shù)時(shí)取腺肌病病灶組織 1份,對(duì)照組手術(shù)時(shí)取正常子宮內(nèi)膜組織 1份,立即用10%甲醛固定,常規(guī)脫水及石蠟包埋,每份標(biāo)本常規(guī)行HE染色后光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài),篩選組織標(biāo)本。用APES進(jìn)行防脫片處理,切片厚度為4μm,撈片后置烤箱 60℃,2h取出,切片脫蠟至水。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè):采用免疫組化 SABC法,實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行,以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù),DAB顯色,同時(shí)用 PBS代替一抗作為染色的陰性對(duì)照。VEGF、MVD檢測(cè)用已知的陽(yáng)性乳腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照,EPO檢測(cè)用已知的EPO染色陽(yáng)性的胎兒腎臟組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。本研究一抗選用VEGF多克隆抗體、鼠抗人單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司提供)或鼠抗人CD34單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)。SABC免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。

2.3 結(jié)果判定:高倍顯微鏡下全面觀察每張切片,隨機(jī)選擇 5個(gè)具有代表意義的高倍視野:VEGF檢測(cè):采用上海山富科學(xué)儀器有限公司 Biosens Digital Imaging System進(jìn)行分析,用平均灰度反映陽(yáng)性強(qiáng)度;MVD檢測(cè):計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野所有染色的微血管,取其平均值作為該切片的MVD;EPO檢測(cè):高倍顯微鏡(10×40)下觀察該 5張切片視野中細(xì)胞著色情況,胞質(zhì)、胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。綜合陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定,參照文獻(xiàn)[1]作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(5個(gè)視野的平均數(shù)),無表達(dá)者為陰性(0分),1%～15% 者為可疑陽(yáng)性(1分),16%～50%者為弱陽(yáng)性(2分),51%～85%者為陽(yáng)性(3分),86%～100% 者為強(qiáng)陽(yáng)性(4分)。按公式[(陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù))/2]計(jì)算該標(biāo)本的陽(yáng)性指數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料兩均數(shù)差異比較采用t檢驗(yàn)或t’檢驗(yàn)。

結(jié) 果

VEGF、MVD及EPO在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)結(jié)果,見附表。由附表可見,在整個(gè)月經(jīng)周期中腺上皮細(xì)胞均有 VEGF表達(dá),在間質(zhì)細(xì)胞中只有散在表達(dá)。VEGF腺肌病組在增生期及分泌期異位內(nèi)膜中的表達(dá)與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。MVD腺肌病組在增生期及分泌期異位內(nèi)膜中的表達(dá)與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。EPO在腺肌病組中以陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主,棕黃色顆粒集中于胞質(zhì),胞核少量表達(dá),明顯高于對(duì)照組,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01);腺肌病組子宮內(nèi)膜的陽(yáng)性指數(shù)明顯高于對(duì)照組,與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。

附表 VEGF、MVD及EPO在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)比較(±s)

附表 VEGF、MVD及EPO在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)比較(±s)

與對(duì)照組比,*P＜0.05,△P＜0.01

對(duì)照組 39 42.16±0.52* 54.26±0.32* 13.8±1.20* 21.8±1.16* 4.08±1.52△ 4.27±2.12△

討 論

子宮腺肌病(Adenomyosis,AMS)患者與多次妊娠和分娩時(shí)子宮壁創(chuàng)傷和慢性子宮內(nèi)膜炎等刺激局部血管增生,利于子宮內(nèi)膜組織侵入子宮肌層,并與高雌激素水平有關(guān)。血管生成不僅在子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)修復(fù)中起作用,而且對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)的發(fā)生發(fā)展也有重要作用。促使血管生成的因子有V EGF,FGF-2(纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2),IL-8(白細(xì)胞介素-8),EGF(表皮生長(zhǎng)因子)和Epo(促紅細(xì)胞生成素)[2]等。其中VEGF能刺激血管生成,被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的促血管生成因子[3],推測(cè)其有可能通過自分泌或旁分泌的方式調(diào)控著異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)、種植和發(fā)展。

VEGF主要由巨噬細(xì)胞分泌是一種高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原,最先從腫瘤細(xì)胞分離出來,是一種結(jié)合肝素的二聚體蛋白,其糖蛋白單體以二硫鍵結(jié)合成二聚體才有活性,是通過酪氨酸激酶?jìng)鲗?dǎo)通路發(fā)揮作用的。現(xiàn)已證實(shí)VEGF及其家族成員不單在腫瘤血管生成,在其它生理和病理的血管生成中都是必不可少的誘導(dǎo)因子。VEGF在胚胎發(fā)育、女性生殖周期、傷口愈合等正常生理過程和腫瘤、炎癥等病理生理過程中均是調(diào)控血管生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)VEGF的生物學(xué)作用有:①特異地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和血管生成。②體外無血清培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)作為生長(zhǎng)因子促進(jìn) Bcl-2和AI等抗凋亡蛋白表達(dá)。③促進(jìn)纖溶酶原激活物、金屬蛋白酶和間質(zhì)膠原酶的表達(dá),致使細(xì)胞非基質(zhì)降解和腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。④增加血管的通透性和血漿蛋白外滲,為血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。其它血管生成因子的血管生成作用全部或部分通過增強(qiáng)VEGF的表達(dá)及生成作用來實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),子宮腺肌病異位內(nèi)膜中VEGF的表達(dá)無論在增生期還是分泌期均明顯高于對(duì)照組,提示異位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜有明顯的不同,VEGF的過度表達(dá)可能與這種內(nèi)膜腺體及間質(zhì)的遷移生長(zhǎng)有密切關(guān)系。

MVD是評(píng)價(jià)血管生成的指標(biāo),CD34為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[4],它的表達(dá)有助于進(jìn)行微血管密度(MVD)的定量分析,反映子宮內(nèi)膜新生毛細(xì)血管的生長(zhǎng)情況。子宮內(nèi)膜組織中MVD越高說明新生毛細(xì)血管越豐富。本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜中均有 CD34的表達(dá),但在異位內(nèi)膜 CD34明顯高于正常內(nèi)膜,提示子宮腺肌病異位內(nèi)膜一旦脫落逆流,則具有較強(qiáng)的微血管增生能力,有利于異位種植生長(zhǎng)。子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展與內(nèi)膜組織的侵襲及血供的支持密切相關(guān),此過程受多種細(xì)胞因子及蛋白水解酶的調(diào)控。

EPO是一種糖蛋白激素,由 165個(gè)氨基酸組成,早期由胎肝產(chǎn)生,后逐漸轉(zhuǎn)移至腎臟產(chǎn)生,成年后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。作為一種細(xì)胞因子廣泛地參與了多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡等各種生理和病理過程,EPO其作用也不僅僅是促進(jìn)紅系細(xì)胞的發(fā)育,而且參與了抗凋亡、抗缺氧、促進(jìn)新生血管生成等病理生理學(xué)過程。本研究結(jié)果顯示,腺肌病患者異位內(nèi)膜腺上皮EPO的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組,而且 EPO主要集中于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞,這與韓燕華等[5]報(bào)道相似,推測(cè)EPO的這種異常增高可能參與了腺肌病的發(fā)病過程。子宮腺肌病患者異位內(nèi)膜可能因 EPO過度表達(dá)而表現(xiàn)出比正常子宮內(nèi)膜更強(qiáng)的血管生成能力,腺肌病患者 EPO表達(dá)增強(qiáng)提示腺肌病中血管生成處于較活躍的狀態(tài),子宮內(nèi)膜間質(zhì)血管滲透性增加,并導(dǎo)致間質(zhì)水腫和纖維素沉積,可以誘導(dǎo)血管生成,為子宮內(nèi)膜侵入子宮肌層創(chuàng)造條件,異位病灶具有很強(qiáng)的血管生成能力得以存活,使異位內(nèi)膜獲得血供而進(jìn)一步侵襲、發(fā)展,病灶不斷擴(kuò)大,加速異位內(nèi)膜的種植。

我們的研究表明,VEGF、MVD和EPO參與調(diào)控血管生成,在子宮內(nèi)膜侵襲種植及新生血管形成網(wǎng)絡(luò)過程中起重要作用,它在組織中的表達(dá)反映了該組織的血管生成活性程度,與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

[1] Watanabe H,Kanzaki H,Narukawa S.Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during themenstrual cyclein relation to endometrial cell apoptosis[J].Am JObstet Gynecol,1997,176:360-368.

[2] Jaquet K,Krause K,Tawakol-Khodai M.Erythropoietin and V EGF exhibit equal angiogenic potential[J].Microvasc Res,2002,64(2):326-333.

[3] Li HM,Zhao AZ,Dou HF,etal.Expression of VEGF in hepatic hemangioma and its clinical implication[J].Fourth Mil Med Univ,2002,23(7):606-607.

[4] Kimura H,Fnakajima.Kingiogensis in hepatocellular carcinoma as evaluated by CD34 immunohistochemistry[J].Liver,1998,18:14-19

[5] 韓燕華,周應(yīng)芳,鄭淑蓉.子宮腺肌病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002,9:539-541.