鴨腸炎病毒感染鴨外周血淋巴細(xì)胞變化研究

馬 波，李洪濤，劉峰源，張 揚(yáng)，劉曉玫，烏伊罕，王君偉*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

養(yǎng)鴨業(yè)已成為我國僅次于家雞馴養(yǎng)的第二大群體[1]，有效防治各種疫病[2]，對于我國養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展尤為重要。鴨病毒腸炎（Duck viral enteritis，DVE）又名鴨瘟（Duck plague，DP），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病在全世界范圍內(nèi)流行，1923年在荷蘭首次報(bào)道，我國于1957年首次爆發(fā)，全國多省份均有流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

由于水禽免疫系統(tǒng)與較為低等的爬行類動物更為接近，不同于哺乳動物及雞的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致目前尚未闡明DEV的感染機(jī)制及免疫機(jī)理。近年來國內(nèi)學(xué)者對DEV病原及體液免疫方面的研究逐漸增多[4－6]，但關(guān)于外周血淋巴細(xì)胞在DEV感染中作用的研究相對較少。

本研究通過建立的MTS法檢測DEV對鴨外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響，初步揭示了鴨外周血淋巴細(xì)胞在DEV感染期間的一個動態(tài)變化過程，對于進(jìn)一步認(rèn)識細(xì)胞免疫在抗DEV感染過程中的作用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

鴨腸炎病毒弱毒疫苗（購自哈藥集團(tuán)黑龍江省生物制品一廠，批號為200703）；鴨腸炎病毒AV1221標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株和C－KCE疫苗毒株（均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)系保存）。

1.1.2 試驗(yàn)動物分組及免疫

4周齡雄性非免疫金定鴨（購自哈爾濱市某養(yǎng)殖場），飼養(yǎng)至12周齡隨機(jī)分成兩組，一組3只為非免疫組（NI組），另一組6只為免疫組（IM組），兩組隔離飼養(yǎng)。免疫程序如下：DEV弱毒疫苗胸肌免疫，1.5個月后用 2×105TCID50DEV AV1221標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株鴨胚尿囊液攻毒，于正式試驗(yàn)前7 d進(jìn)行弱毒疫苗加強(qiáng)免疫。

1.1.3 主要試劑

胰蛋白酶（購自Difco公司）；RPMI 1640（購自Gibco公司）；新生小牛血清（購自上海偉群生物技術(shù)有限公司）；PHA、CellTiter 96@AQueousNon－Radioactive Cell Proliferation Assay（G5421）（購自 Promega公司）；淋巴細(xì)胞分層液（購自中國科學(xué)院血液研究所）。

1.1.4 主要儀器

水平離心機(jī)（LD5－2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；超純水系統(tǒng)（Milli－Q Academic，密理博）；倒置生物顯微鏡（OLYMPUS TOKYO 210942，奧林帕斯）；自動酶標(biāo)檢測儀（Model680，伯樂）；超凈工作臺（DL－CJ－2N，哈市東聯(lián)電子有限公司）；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（REVCO RCO 3000.TVBB）。

1.2 方法

1.2.1 鴨外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的確定

用40 g·L－1的檸檬酸鈉作為抗凝劑，足靜脈采集非免疫鴨外周血5 mL，將抗凝血輕輕疊加在盛有等體積的淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077±0.002 g·mL－1）的試管中，1 000 r·min－1室溫水平離心 11 min，小心吸取界面細(xì)胞，用適量預(yù)熱的含100 mL·L－1FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，每次1 000 r·min－1室溫下離心 11 min。細(xì)胞沉淀重懸于2 mL 1640完全營養(yǎng)液培養(yǎng)液，6 g·L－1臺盼藍(lán)拒染，活淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106和2×106個·mL－1兩個濃度。將細(xì)胞加于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔加200 μL細(xì)胞懸液，同時加入200 μg·mL－1的 PHA 5、10、20 μL，PHA 終濃度分別為5、10、20 μg·mL－1，每個濃度做 2 個重復(fù)，同時設(shè)置陰性對照和空白對照，37℃ 50 mL·L－1CO2分別培養(yǎng)48、72、96 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔吸棄100 μL培養(yǎng)液，不要干擾細(xì)胞，加入10 g·L－1MTS/PWS 20 μL 至終濃度為 333 μg·mL－1MTS、25 mmol·L－1PWSL，37 ℃ 50 mL·L－1CO2繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，取出培養(yǎng)板后立即在OD490nm處利用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光值，計(jì)算刺激指數(shù)（Stimulation index，SI），確定最佳反應(yīng)時間、細(xì)胞濃度和刺激物濃度。刺激指數(shù)（SI）=（試驗(yàn)孔平均Dλ－空白孔平均Dλ）/（對照孔平均Dλ－空白孔平均Dλ）。

1.2.2 DEV感染鴨外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的確定

根據(jù)上面試驗(yàn)確定的細(xì)胞濃度摸索抗原特異性T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)的條件。取3只免疫鴨，淋巴細(xì)胞分離及其他試驗(yàn)方法同前。特異性刺激原 DEV 分別進(jìn)行 10－1～10－4稀釋，每孔加2 μL，最終稀釋度為 10－3～10－6，培養(yǎng) 48、72、96 h后處理方法同前，確定最佳反應(yīng)時間和DEV刺激濃度。

1.2.3 DEV感染鴨外周血淋巴細(xì)胞的變化

根據(jù)上面確定的最佳反應(yīng)條件，對免疫組和非免疫組鴨外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，分別在末次免疫后第1、2、4和6周進(jìn)行檢測。具體操作方法同前，設(shè)置PHA、陰性及空白對照，每個樣品做3個重復(fù)。利用SPSS 12.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的確定

以PHA為刺激物，細(xì)胞濃度為2×106和1×106個·mL－1，刺激時間為24、48和72 h，計(jì)算相應(yīng)刺激指數(shù)（SI），結(jié)果見表1。從表1可以看出SI最高為2.3269，此時的條件為：細(xì)胞濃度1×106個·mL－1，PHA 終濃度 5 μg·mL－1、刺激時間 72 h，因此將上述條件作為鴨外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最佳反應(yīng)條件。

2.2 DEV感染鴨外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的確定

按照已確定的細(xì)胞濃度摸索DEV最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)時間，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，DEV在終稀釋度為10－3，培養(yǎng)72 h時達(dá)到最高SI，因此確定上述試驗(yàn)條件為DEV最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)時間。

表1 以PHA為刺激物不同反應(yīng)條件的SI值Table 1 SI in different reaction condition stimulated with PHA

表2 特異性抗原不同反應(yīng)條件的SI值Table 2 SI in different reaction condition stimulated with DEV

2.3 DEV感染鴨外周血淋巴細(xì)胞的變化

DEV和PHA刺激IM組不同個體SI隨時間變化結(jié)果見表3，從表3可以看出不同個體SI隨時間變化的總體趨勢是從第1周開始逐漸升高，第4周后達(dá)到高峰，第6周回落至接近第2周的水平。其中8039、8048和8049較為典型，但總體看由于個體之間存在差異，導(dǎo)致SI開始上升的起點(diǎn)和達(dá)到高峰的時間不完全相同，如8038和8050對DEV的轉(zhuǎn)化分別是從第2周和第4周開始升高的，在第4周和第6周達(dá)到高峰。同時發(fā)現(xiàn)初始值較高的個體所達(dá)到的最高值較低，如8038初始值為1.225最高值為1.282，而初始值較低的個體所達(dá)到的最高值反而較高，如8039初始值為0.834，最高值為1.967。同一個體對DEV和PHA的反應(yīng)表現(xiàn)出一致的趨勢。

DEV和PHA刺激NI組不同個體SI隨時間變化的結(jié)果見表4，從表4可以看出NI組不同個體SI隨時間并未出現(xiàn)較大幅度的變化，且不同個體間差異較小。除第2周SI均略高于其他3周外，第1、4和6周差異較小。第2周SI普遍較高可能是由于試驗(yàn)誤差造成。同一個體對DEV和PHA的反應(yīng)表現(xiàn)出一致的趨勢。

表3DEV、PHA刺激IM組不同個體SI隨時間變化結(jié)果Table 3 Variation of SI in IM group stimulated with DEV and PHA

表4 DEV、PHA刺激NI組不同個體SI隨時間變化結(jié)果Table 4 Variation of SI in NI group stimulated with DEV and PHA

分別將DEV和PHA刺激IM組和NI組的SI平均值進(jìn)行比較，結(jié)果見表5，圖1、2。

由表5，圖1、2結(jié)果可知，IM組和NI組對DEV和PHA的刺激均表現(xiàn)為第1、2周IM低于NI組，第4、6周IM高于NI組，且IM組PHA變化幅度最大，由此同樣揭示出IM組不同時間SI變化明顯，出現(xiàn)逐漸升高而后降低的趨勢，而NI組不同時間SI基本持平。

表5DEV、PHA刺激IM組和NI組SI平均值隨時間變化結(jié)果Table 5 Comparison of SI means between immune group and non immune group stimulated with DEV and PHA

圖1 DEV刺激免疫組和非免疫組的SI平均值比較Fig.1 Comparison of SI means between IM group and NI group stimulated with DEV

3 討論與結(jié)論

圖2 PHA刺激免疫組和非免疫組的SI平均值比較Fig.2 Comparison of SI means between IM group and NI group stimulated with PHA

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是檢測抗原特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量的常用方法，檢測DEV抗原特異性外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的MTS法尚未見報(bào)道，本研究建立了該方法并用于檢測DEV免疫鴨外周血淋巴細(xì)胞變化趨勢。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中免疫組總體呈現(xiàn)的變化趨勢為逐漸升高，達(dá)到頂峰而后回落，即第1周與第2周相比略高、持平或略低，但差距不大，第4周均有不同程度的升高，第6周回落至初始水平或比初始水平略高。由此，推斷該體外變化規(guī)律也體現(xiàn)了整個機(jī)體對DEV進(jìn)行細(xì)胞免疫應(yīng)答時回憶應(yīng)答的規(guī)律，表現(xiàn)為細(xì)胞免疫水平從末次免疫后可持續(xù)上升近4周達(dá)到高峰，4～6周開始逐漸回落。細(xì)胞免疫水平上升較為緩慢而下降卻相對較快，這可能與鴨免疫系統(tǒng)本身的特點(diǎn)有關(guān)，在鴨肝炎病毒（DHBV）表面抗原和核心抗原引起鴨細(xì)胞免疫應(yīng)答動力學(xué)的研究中存在一致現(xiàn)象[7]。

從本試驗(yàn)中還可以看出，不同試驗(yàn)鴨對DEV反應(yīng)的能力表現(xiàn)不一致，表現(xiàn)為反應(yīng)強(qiáng)的個體達(dá)到高峰的時間早且強(qiáng)度高，而反應(yīng)弱的個體達(dá)到高峰的時間晚且強(qiáng)度小，前者如8039、8048、8049，后者如8038和8050。分析引起上述現(xiàn)象的原因主要有：①不同試驗(yàn)鴨個體間的確存在差異，這與鴨肝炎病毒免疫相關(guān)研究的報(bào)道一致[7－8]；② DEV可感染外周血淋巴細(xì)胞（PBL），并在此繁殖或潛伏，從而引起外周血淋巴細(xì)胞損傷，造成不同個體針對DEV的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平的起始點(diǎn)不同，這與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。

岳華等先后利用不同檢測方法證明DEV無論強(qiáng)毒株還是弱毒株均可感染胸腺、法氏囊、脾臟、外周血等中樞或外周免疫器官，且病毒在三叉神經(jīng)節(jié)及外周血淋巴細(xì)胞中可穩(wěn)定存在并形成潛伏感染[4,9－11]。同時陽性對照PHA的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果也證明了該點(diǎn)，即IM組的PHA反應(yīng)能力在前兩周明顯低于NI組，到第4周才高于NI組，這與李玲的研究結(jié)果一致[12]。

本研究證實(shí)MTS法可有效檢測鴨抗原特異性外周血淋巴細(xì)胞增殖情況，且鴨外周血淋巴細(xì)胞可潛伏感染DEV。

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