分子標(biāo)記在長豇豆遺傳分析中的應(yīng)用進(jìn)展

張靜，彭海，陳禪友

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢，430056）

豇豆（Vigna unguiculataL.Walp.）是一種重要的豆科植物，全球種植面積超過12 500萬hm2，年產(chǎn)量超過300萬t[1]。豇豆起源于非洲，傳入亞洲后，在中國與印度分別形成了長豇豆（V.sesquipedalis）與短豇豆（V.cylindrica）2個(gè)栽培亞種，另外有1個(gè)亞種為普通豇豆（V.unguiculata），故栽培豇豆共有3個(gè)亞種。其中，長豇豆是豇豆中經(jīng)濟(jì)性上很重要的一個(gè)亞種，可菜用，還可作動(dòng)物飼料[2]，因而被廣泛種植于東南亞與中國各地。中國是長豇豆的次生起源中心[3]，具有悠久的栽培歷史。中國地域遼闊、生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，長豇豆在全國各地都有種植，因此形成了豐富的長豇豆地方品種。加之近年來長豇豆育種工作日見成效，進(jìn)一步豐富了中國長豇豆遺傳資源庫，需要對這些資源進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，為品種資源保存、利用、育種以及解決品種爭議打下基礎(chǔ)。結(jié)合我們的研究成果，本文介紹了分子標(biāo)記在長豇豆遺傳資源鑒定中的應(yīng)用情況，并針對存在的問題，提出了幾點(diǎn)看法。

1 用于長豇豆遺傳分析的分子標(biāo)記類型及其體系的建立

一般來說，蛋白質(zhì)分子標(biāo)記如各種同工酶的提取與電泳檢測在各種植物中程序變化不大，因此，一般不需要建立和優(yōu)化反應(yīng)體系。由于不同植物基因組堿基組成不同，而以PCR為基礎(chǔ)的眾多分子標(biāo)記都需要引物與基因組配對才能擴(kuò)增，因此反應(yīng)條件存在差異。需要針對不同植物種類和分子標(biāo)記類型對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化才能獲得最佳的擴(kuò)增效果。

ISSR是由Zietkiewicz等[4]提出的用于擴(kuò)增兩個(gè)距離較近的相鄰SSR位點(diǎn)間序列的一種方法。其原理是同一ISSR引物序列同時(shí)與兩個(gè)距離較近但方向相反的SSR重復(fù)序列互補(bǔ)結(jié)合[5]，在模板、Taq酶和dNTP等存在的情況下擴(kuò)增這兩個(gè)SSR位點(diǎn)間的序列，因此ISSR變異來源于SSR位點(diǎn)多態(tài)性本身與SSR位點(diǎn)間的序列變異。在牛筋草和高粱的遺傳分析中，ISSR技術(shù)被認(rèn)為比RFLP更便宜，比RAPD重復(fù)性更高[5～6]。ISSR技術(shù)被認(rèn)為更適合于遺傳多樣性較低的栽培品種內(nèi)的遺傳分析[7～8]，而通過RAPD等分子標(biāo)記檢測，豇豆種內(nèi)多態(tài)性較低，作為豇豆的一種亞種，長豇豆內(nèi)多態(tài)性應(yīng)更低，因此，推測高多態(tài)性的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)適合長豇豆亞種DNA多態(tài)性分析。彭海等[9]對長豇豆ISSR反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的濃度進(jìn)行了初步篩選，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定了這4種關(guān)鍵成分的最終濃度，即引物為0.2 μM、模板為0.75 ng/μL、dNTP各200 μM/L和Taq聚合酶為0.5 U時(shí)，ISSR擴(kuò)增效果最好。由于不同ISSR引物組成差異較大，除各種PCR反應(yīng)成分要影響ISSR擴(kuò)增帶型外，引物退火溫度也可顯著影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，彭海等[10]通過試驗(yàn)測定獲得了長豇豆品種25條ISSR引物的最佳退火溫度，發(fā)現(xiàn)不同引物間的差異較大，變異系數(shù)達(dá)到8.80%。與理論推測的退火溫度比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)測值與理論值間不具有明顯的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)僅為0.37。因此認(rèn)為，可能試驗(yàn)實(shí)測是獲得最佳退火溫度的唯一途徑。在長豇豆ISSR-PCR分析過程中，彭海等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板濃度為0時(shí)（空白對照），ISSR反應(yīng)同樣可以擴(kuò)增出條帶。因此ISSR引物可以在所有生物中通用，由于空氣中不可避免地存在微生物，因此，我們認(rèn)為，污染應(yīng)來源于空氣中的微生物等。由于科學(xué)研究最基本的要求是現(xiàn)象能夠重現(xiàn)，而污染問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到了這一原則。因此建議，在長豇豆ISSR與RAPD反應(yīng)中都應(yīng)該注意微生物污染的問題，整個(gè)反應(yīng)體系所涉及的藥品與器材應(yīng)消毒，且整個(gè)操作應(yīng)在超凈工作臺上嚴(yán)格進(jìn)行，同時(shí)應(yīng)在反應(yīng)中設(shè)立陰性對照，陽性也應(yīng)設(shè)重復(fù)，以監(jiān)控污染是否產(chǎn)生。

微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列（SSR）是指1~6個(gè)核苷酸所組成的串聯(lián)重復(fù)序列，SSR標(biāo)記是一種以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)[12～13]。因其變異頻率高，其在遺傳作圖以及分析種間、亞種間、品種間甚至是品種內(nèi)親緣關(guān)系等方面都是一種理想的工具[14~16]。在禾本科植物如水稻[17]，以及豆類植物如大豆[18]、四季豆[19]中都已經(jīng)開發(fā)出較多的SSR引物。但在豇豆中開發(fā)的微衛(wèi)星引物較少，僅Li等[20]開發(fā)了65對微衛(wèi)星引物，并證明其中27對引物能擴(kuò)增出多態(tài)性帶。之后這27對微衛(wèi)星引物被多次應(yīng)用于豇豆遺傳多樣性的研究中[21～22]。彭海等[23]對長豇豆SSR反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的濃度進(jìn)行了正交設(shè)計(jì)分析，結(jié)果表明引物濃度對長豇豆SSR擴(kuò)增影響明顯，其他3種成分濃度沒有顯著影響，基因組差異亦對反應(yīng)沒有明顯影響。通過進(jìn)一步引物濃度試驗(yàn)并結(jié)合成本考慮，確定長豇豆SSR反應(yīng)中成分的最佳濃度為：模板 1 ng/μL、引物 1.6 μmol/L、dNTP 100 μM/L、Taq聚合酶0.5 U。利用優(yōu)化后的程序，彭海等[24]進(jìn)一步對這27對已報(bào)道的SSR引物針對長豇豆進(jìn)行了篩選，但僅有13對引物能對長豇豆基因組進(jìn)行有效擴(kuò)增。用這13對SSR引物對67份長豇豆品種進(jìn)行分析表明：僅5對具有多態(tài)性（資料待發(fā)表）。以上資料表明，需要進(jìn)一步針對長豇豆開發(fā)SSR引物數(shù)量，才能利用其分析長豇豆亞種遺傳關(guān)系。

Vos等[25]于1995年公布了AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)的大致原理與流程如下：利用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割基因組，分別利用與酶切位點(diǎn)配對的接頭與酶切片斷連接，再利用與接頭配對的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)和選擇性擴(kuò)增。AFLP分子標(biāo)記有兩大特點(diǎn)。第一，與ISSR分子標(biāo)記類似，可用于任何物種；第二，每一對引物組合擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)一般可達(dá)到50~100，擴(kuò)增效率極高。因此，在其他分子標(biāo)記都無法找到多態(tài)性時(shí)，一般AFLP可有效地獲得多態(tài)性標(biāo)記。豇豆栽培種中其他分子標(biāo)記如RAPD所揭示的多態(tài)性不到20%[22，26]，遠(yuǎn)不及其他作物[27～28]，因此，AFLP分子標(biāo)記在對長豇豆亞種遺傳多樣性分析中具有其特殊作用。然而，AFLP分析涉及酶切、連接、預(yù)擴(kuò)、選擴(kuò)和電泳等復(fù)雜程序，因此，容易產(chǎn)生假陽性，為了準(zhǔn)確獲得研究結(jié)果，有必要對AFLP反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化。劉永華等[29]利用抗病與感病長豇豆為材料，建立并優(yōu)化了長豇豆AFLP反應(yīng)程序。除AFLP標(biāo)準(zhǔn)程序外，他認(rèn)為高質(zhì)量的基因組DNA是AFLP試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。我們也認(rèn)為，基因組DNA質(zhì)量好壞，影響酶切是否徹底，能決定最終結(jié)果中假陽性的比率。我們試驗(yàn)了SDS，CTAB和試劑盒提取的長豇豆基因組DNA對酶切效果的影響，發(fā)現(xiàn)都存在酶切不完全的現(xiàn)象（資料未發(fā)表）。特別值得一提的是：雖然利用植物基因組試劑盒提取的DNA從分光光度計(jì)和電泳檢測結(jié)果來看，質(zhì)量都很好，但酶切效果依然較差。通過在標(biāo)準(zhǔn)提取程序中添加PVP和1%β-巰基乙醇，并且采用超純水而不是TE溶解DNA，可以很大程度上解決酶切不充分的問題。由此可見，基因組DNA提取雖然已是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)操作，但應(yīng)用于高敏感性的AFLP反應(yīng)程序中，依然存在較多需討論之處。

2 分子標(biāo)記在長豇豆遺傳分析中的應(yīng)用

直接以長豇豆為材料的研究不太多。胡志輝等[30]利用過氧化氫酶（CAT）和淀粉酶（AMY）的同功酶酶譜分析了21個(gè)長豇豆品種的多樣性，獲得的3個(gè)多樣性位點(diǎn)可區(qū)分所供試的長豇豆品種。然而，Reis等[31]利用等位酶標(biāo)記分析了豇豆遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)整個(gè)豇豆屬內(nèi)多態(tài)性都不高，且利用等位酶無法將長豇豆亞種與其他豇豆亞種區(qū)分開來。同樣，Panella等[32]雖然認(rèn)為等位酶可以很好地對豇豆種進(jìn)行劃分，但不能在栽培種之間進(jìn)行區(qū)分。說明等位酶標(biāo)記在豇豆特別是長豇豆遺傳多樣性分析中存在一定局限性。利用細(xì)胞保護(hù)酶標(biāo)記和形態(tài)學(xué)標(biāo)記，Chen等[33]進(jìn)一步分析了23個(gè)長豇豆品種對鹽脅迫的響應(yīng)，利用系統(tǒng)聚類，將這23個(gè)品種分為耐鹽和不耐鹽兩個(gè)明顯類群，顯示了細(xì)胞保護(hù)酶標(biāo)記等在耐鹽長豇豆資源鑒定中的作用。利用Li等[20]開發(fā)的SSR引物，Phansak等[34]對全球范圍內(nèi)15個(gè)長豇豆品種在16個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)上的多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在相似系數(shù)為0.67處，可將這些長豇豆分為3個(gè)類群，然而，它們似乎與長豇豆的地理起源并無關(guān)系。該研究中，中國起源的長豇豆品種僅3個(gè)，由于品種數(shù)少，在全基因組范圍內(nèi)檢測的位點(diǎn)數(shù)也僅有16個(gè)，可能造成結(jié)果可靠性變差，且對長豇豆品種，特別是中國長豇豆品種的代表性較差。Sarutayophat等[35]利用5個(gè)RAPD引物分析了37份長豇豆品種遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些RAPD引物能相對較好地將長豇豆和豇豆分成不同的類群。最近，陳禪友等[36]利用23個(gè)有效RAPD分子標(biāo)記分析了40個(gè)長豇豆品種遺傳多樣性，根據(jù)長豇豆品種DNA分子RAPD系統(tǒng)樹圖，可將長豇豆品種分為5個(gè)品種群，從而彌補(bǔ)根據(jù)形態(tài)性狀異同來判別品種的不足，研究揭示了由于自然和人工選擇可遺傳性狀變異積累、地理隔離歧化和人工雜交強(qiáng)化基因重組等共同作用而形成的品種基因組差異的現(xiàn)實(shí)。

其他研究部分涉及長豇豆亞種。Chen等[37]利用種子貯藏蛋白分析了中國栽培豇豆屬及近緣屬遺傳變異，分析涉及早翠等7個(gè)長豇豆品種代表。研究發(fā)現(xiàn)：長豇豆亞種內(nèi)品種間差異很小，所用的7個(gè)品種僅顯示出3種帶型，且彼此相似。相反，大豆品種間和飯豆品種間呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性。兩個(gè)豌豆品種表現(xiàn)出種內(nèi)相似的種子蛋白質(zhì)帶型，但能夠彼此區(qū)分。該研究與前人利用RAPD等[22，26]分子標(biāo)記對長豇豆遺傳多樣性分析的結(jié)果相類似，即多態(tài)性都不高。與Chen等[37]研究相對應(yīng)，F(xiàn)ana Sylla等[38]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究了豇豆栽培種、野生種及其近緣種間的親緣關(guān)系。但長豇豆亞種內(nèi)僅2個(gè)品種，分別來自蘇格蘭和菲律賓。在擴(kuò)增獲得的202個(gè)RAPD條帶中，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)條帶僅長豇豆亞種中含有，顯示了它們在區(qū)分長豇豆亞種與其他豇豆亞種中的潛在作用。另一項(xiàng)類似研究的材料涉及意大利的豇豆地方品種和一個(gè)長豇豆選育品種[39]。雖然長豇豆材料所占比重很小，但74.6%的RAPD多態(tài)性帶型都由長豇豆所特有，其中24個(gè)RAPD引物可將意大利育成的長豇豆品種與其他豇豆地方品種區(qū)分開[39]，顯示了長豇豆與其他豇豆品種在分子標(biāo)記上存在巨大差異，或者，這些RAPD引物可能與育種者所關(guān)心的一些關(guān)鍵性狀如產(chǎn)量、抗性等緊密連鎖。

除RAPD外，其他分子標(biāo)記也被廣泛用于長豇豆資源分析中。Archana等[40]利用SSR分子標(biāo)記分析了豇豆屬遺傳多樣性，其中包含一個(gè)來源于中國的長豇豆品種。結(jié)果表明：長豇豆亞種在聚類圖上比豇豆的另一原始栽培亞種textilis更接近普通豇豆亞種。Fatokun等[41]在利用RFLP標(biāo)記分析豇豆親緣關(guān)系時(shí)也得到了類似結(jié)論：長豇豆亞種在聚類圖上與其他栽培種和野生亞種dekindtiana關(guān)系密切。這些結(jié)論都與長豇豆的起源與傳播過程相一致。但另一些研究結(jié)論與此存在一定差異。Gillaspie等[42]利用AFLP和SSR分子標(biāo)記分析了豇豆不同亞種間的遺傳關(guān)系，其中涉及3個(gè)長豇豆品種。雖然AFLP和SSR標(biāo)記的多態(tài)性都較高，但聚類結(jié)果卻顯示豇豆野生亞種dekindtiana被混入了長豇豆栽培亞種之中。此現(xiàn)象與形態(tài)學(xué)觀察相差甚遠(yuǎn)，因?yàn)殚L豇豆屬于栽培種，與野生亞種dekindtiana差別相當(dāng)明顯，如種子更大等。同樣，26個(gè)有效的DAF標(biāo)記并不能將長豇豆亞種與短豇豆亞種區(qū)分開來[43]。以上結(jié)果提示我們：在豇豆或長豇豆亞種內(nèi)遺傳多樣性分析中，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，仔細(xì)分析分子標(biāo)記的結(jié)果，否則容易出現(xiàn)明顯的偏頗。值得一提的是，Tosti等[39]比較了RAPD、AFLP和SAMPL標(biāo)記在分析豇豆地方品種（含長豇豆）親緣關(guān)系中的利用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)SAMPL標(biāo)記所需要的引物數(shù)最少，且與表型相關(guān)性最為顯著，顯示SAMPL標(biāo)記在豇豆親緣關(guān)系分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢。

3 問題與展望

3.1 針對長豇豆的SSR分子標(biāo)記過少

雖然各種分子標(biāo)記都可應(yīng)用于長豇豆遺傳關(guān)系分析，然而各種分子標(biāo)記在豇豆資源鑒定中各有其自身優(yōu)勢與不足。RAPD標(biāo)記檢測的位點(diǎn)多，引物通用，但普遍認(rèn)為不夠穩(wěn)定，而且在豇豆中RAPD標(biāo)記不能反應(yīng)親緣關(guān)系，被認(rèn)為不適合做豇豆親緣關(guān)系分析[22]。AFLP與SAMPL標(biāo)記的多態(tài)性很高，能夠有效區(qū)分普通豇豆不同品種[26]，然而酶切、擴(kuò)增與PAGE檢測程序復(fù)雜，費(fèi)用高，在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較多而在品種純度或資源鑒定等研究中應(yīng)用較少。ISSR標(biāo)記雖然不需要復(fù)雜的檢測程序且具有較高的多態(tài)性，然而與AFLP、RAPD一樣，屬于非共顯性標(biāo)記，此特點(diǎn)決定其很難用于檢測雜合基因型。SSR標(biāo)記引物序列特異，多態(tài)性高且為共顯性，在資源與種子純度鑒定等方面應(yīng)用最為廣泛，然而目前在整個(gè)豇豆屬中有差異的有效SSR標(biāo)記僅20多個(gè)[20]，由于長豇豆亞種內(nèi)品種間親緣關(guān)系更近，因而有效SSR標(biāo)記更少，根據(jù)我們研究結(jié)果，僅有13對SSR引物能對長豇豆基因組進(jìn)行有效擴(kuò)增[24]，其中僅5對具有多態(tài)性（資料待發(fā)表），還遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，需要開發(fā)更多的長豇豆SSR引物。

3.2 長豇豆分子標(biāo)記多態(tài)性偏低與形態(tài)性狀多態(tài)性高的矛盾

雖然多項(xiàng)分子標(biāo)記如等位酶[31]和DNA標(biāo)記[22,26]的研究結(jié)果都揭示豇豆或長豇豆亞種內(nèi)遺傳多樣性較低，然而它們在莢色、莢長和莢質(zhì)量等形態(tài)學(xué)性狀上存在較大的差異[35,44]，這種現(xiàn)象一方面提示我們在運(yùn)用分子標(biāo)記研究長豇豆遺傳多樣性時(shí)，應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)的結(jié)果進(jìn)行解釋，另一方面也促使我們?nèi)ニ伎迹簽槭裁捶肿訕?biāo)記所揭示的遺傳多樣性并沒有在表型中表現(xiàn)出來？是因?yàn)槲覀兇罅繖z測的變異位點(diǎn)屬于中性變異，與自然選擇或性狀表現(xiàn)無關(guān)嗎？從最近的一項(xiàng)研究來看，這種推測是具有一定依據(jù)的。Li Wang等[45]利用基因起源的分子標(biāo)記研究了美國農(nóng)業(yè)部收集的豇豆資源親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)承受了較小自然選擇壓力的內(nèi)含子比外顯子更能揭示遺傳多樣性。最近，我們研究了長豇豆亞種內(nèi)不同品種間DNA甲基化修飾多態(tài)性差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種間除在DNA序列上存在明顯不同外，在甲基化修飾上也存在明顯的差異（結(jié)果待發(fā)表）。雖然DNA甲基化不能通過傳統(tǒng)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)檢測到，但DNA甲基化卻廣泛參與了植物生長發(fā)育和性狀的表現(xiàn)，因此，以DNA甲基化修飾為代表的表觀遺傳學(xué)可能是遺傳標(biāo)記與形態(tài)學(xué)差異的原因之一。

3.3 需要將分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合

雖然包括陳禪友等[46]在內(nèi)的眾多研究都在形態(tài)學(xué)水平上分析了長豇豆亞種遺傳多樣性，同時(shí)，各種分子標(biāo)記也被多次應(yīng)用于長豇豆遺傳資源鑒定，然而，這二者相結(jié)合的研究卻相對較少。只有當(dāng)分子標(biāo)記所提示的DNA多態(tài)性信息與生物學(xué)功能相結(jié)合才能指導(dǎo)種質(zhì)資源保存與育種實(shí)踐，因此，長豇豆分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合應(yīng)在以后研究中得到加強(qiáng)。

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