HLA-B27陽性者中CD4+CD25brightTreg細胞的檢測及意義

王朋

(浙江省麗水市人民醫(yī)院檢驗科，浙江 麗水 323000)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種原因不明的以中軸關節(jié)慢性炎癥為主的全身性疾病，多侵犯骶髂關節(jié)、髖關節(jié)、椎間關節(jié)和肋椎關節(jié)，本病好發(fā)于青壯年男性，預后差，致殘率高[1]，目前尚無特效的治療方法。CD4+CD25brigt調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)是近十年發(fā)現的T細胞亞群，具有抑制效應T細胞功能的作用。有研究資料表明，其與AS的發(fā)生機制可能有一定的相關性。本研究旨對HLA-B27陽性患者的外周血中CD4+CD25brightTreg細胞的表達情況進行觀察分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 我院門診和住院AS疑似患者416例，其中男205例，女211例，年齡6～87歲，平均年齡(43.72±15.23)歲。對照組20例，為HLA-B27陰性者，其中男16例，女4例，年齡22～61歲，平均年齡(37.50±9.74)歲，均無異常病史，常規(guī)血生化和血免疫學檢測指標以及X線片均正常。

1.2 主要儀器和試劑 美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀。HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑盒；抗 CD4-FITC、抗 CD45-PreCP、抗 CD25-PE 及同型對照 IgG1-PE、CaliBRITE beads、FACS 溶血素等均購自美國BD公司。溶血素使用前先用蒸餾水1:10稀釋配成工作液。

1.3 實驗方法

1.3 .1流式細胞儀檢測HLA-B27首先對416例AS疑似患者進行HLA-B27檢測，具體操作如下：取EDTA抗凝的新鮮全血標本50μl于試管中，加10μl HLA-B27-FITC/CD3-PE試劑，混勻，室溫避光孵育15min，加入1m l溶血素工作液，室溫避光溶血10min，1500r/min×5min 離心后棄上清液，加 PBS 緩沖液2ml，洗滌1次，同速度離心5min，棄上清液，加PBS緩沖液250μl混勻，Worklist自動檢測和分析軟件上機測定HLA-B27。

1.3 .2 CD4+CD25brightTreg細胞檢測 對上述3.1步驟檢測的結果進行統(tǒng)計，在HLA-B27陽性的標本中再隨機抽取其中的25例做為本文的研究對象，進行如下操作：分A和B兩管，首先每管各加EDTA抗凝血標本50μl，然后在A管加抗CD25-PE、抗CD4-FITC、 抗 CD45-PreC；B 管 加 IgG1-PE、抗CD4-FITC、抗 CD45-PreC 各 10μl，混勻，置 4℃冰箱孵育15min后用3.1中同樣的方法溶血并洗滌標本1次，加250μl的PBS緩沖液重懸細胞待上機。數據獲取與分析前使用CaliBRITE三色標準微球和FACSComp軟件調節(jié)和優(yōu)化獲取條件，然后使用CELLQuest軟件畫圖對標本進行上機檢測，最后通過CD45/SSC散點圖對淋巴細胞設門，并在CD4/CD25散點圖上進行結果分析得出數據。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，所有數據以均數±標準差(x±s)表示，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對416例疑似AS患者進行HLA-B27檢測，結果有50例成陽性，陽性率12.02%，在這50例陽性患者中，男36例，女14例，男女陽性比例為2.57:1，男性相對多發(fā)。

2.2在隨機抽取的25例HLA-B27陽性標本中，CD4+CD25brightTreg細胞的均值較對照組偏高，統(tǒng)計結果 t=-3.262，P=0.002(P＜0.05)，二者差別具有顯著的統(tǒng)計學意義。見表1和圖1。

表1 HLA-B27陽性者與健康對照組Treg細胞結果比較(±s)

表1 HLA-B27陽性者與健康對照組Treg細胞結果比較(±s)

注：*與對照組比較P=0.002(P＜0.05)

組別 例數(n) CD4+CD25brightTreg(%)對照組B27陽性組*20 25 2.59±0.76 3.91±1.67

圖1 CD4+CD25bright細胞含量分布

3 討論

AS在我國發(fā)病率約為0.3%[2]，筆者通過對本院門診和住院患者調查發(fā)現HLA-B27在疑似AS患者中的陽性率則占12.02%，年齡最小者15歲，最大者87歲，男女比例為2.57:1，男性相對多發(fā)。這其中最后被確診為AS的患者HLA-B27陽性率達到97.5%，這與孫翠華等人報道的陽性率高于96%[3]，以及夏果等人報道的男女比例2.73:1[4]比較符合。AS的免疫假說認為人類的CD4+T細胞受到抗原刺激后可以向Th1、Th2和Th0三個不同水平的細胞亞群分化，雖然目前已知各亞群細胞受激后可以通過分泌各自相應的細胞因子如：IL-2、IL-10、TNF等進入體液免疫渠道來對AS患者的自身免疫性炎癥反映進行調控，但各個亞群細胞具體在AS發(fā)病中的作用機制目前仍不十分清楚[5]，因此研究和探明它們之間的關系在時下仍十分重要。

筆者通過特異性的檢測HLA-B27陽性患者外周血CD4+CD25brightTreg細胞的含量，把它和HLAB27陰性者相對比，發(fā)現AS患者外周血中的Treg細胞與對照組二者之間具有顯著的統(tǒng)計學差異，且AS患者中CD4+CD25brightTreg細胞含量較對照組偏高，認為AS患者免疫系統(tǒng)可能較正常人活躍[6]，本結果與Crispin等關于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等其它自身免疫性疾病外周血Treg細胞表達水平下降的結論恰好相反[7]。在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，CD4+T細胞受到抗原刺激后可以產生相關的細胞因子，這些因子通過免疫系統(tǒng)與機體自身抗原物質之間作用從而導致機體的炎癥反應，這可能是引起和加重AS患者骶髂、椎間和髖等關節(jié)進行性炎癥變化的重要因素，而同時在AS患者的機體中，高水平的Treg細胞又恰好可以通過它的免疫抑制和免疫耐受這兩個主要功能產生對機體炎癥進展的抑制作用，這兩個對立因素共同作用的結果便是導致AS患者疾病進展相對緩慢。基于這一點，筆者以為Treg細胞水平的適當提高對AS患者的治療應該是有積極意義的，并且在治療過程中對Treg細胞的含量進行定期檢測可能會對AS患者的治療起到監(jiān)測作用。然而，就目前而言，究竟將Treg細胞提高到一個什么水平才能達到臨床想要的結果可能還需進一步探討。

另外，根據對本研究結果的觀察發(fā)現：AS患者不同的個體測定出來的HLA-B27結果的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)也不同，那么，在MFI不同的AS患者中CD4+CD25brightTreg細胞的變化情況又如何？這種變化與疾病之間又會有什么樣的聯系？也許同樣值得研究。

[1] George J, Daniel J.Hiparthroplasty for salvage of failed treatmentofintertrochanteric hip fractures[J].Bone Joint Surg(Am),2003,85-A(5):899-904.

[2]曾慶馀.重視強直性脊柱炎的臨床研究[J].實用醫(yī)學雜志,2002,18(1):111-112.

[3]孫翠華,孟凡杰,王玉芳,等.強直性脊柱炎與HLA-B27相關性的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2007,13(4):281-283

[4]夏 果,潘發(fā)明,張 立,等.112例強直性脊柱炎住院患者臨床特征分析[J].中華疾病控制雜志,2009,(06).

[5]隋 聰,卜海富.強直性脊柱炎發(fā)病機制與治療的研究進展[J].臨床骨科雜志,2010,13(2):217-220.

[6]黃 河,汪亞東,孫燕燕,等.強直性脊柱炎患者外周血中調節(jié)性T細胞水平研究[J].中國熱帶醫(yī)學,2009,(10)

[7]Crispin JC，Martinez A，Alocer-Varela J.Quantification of regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus[J].JAutoimmune， 2003，21(3)：273～276.