地黃多糖的提取純化工藝研究

趙平鴿，劉曉（1.浙江義烏市中心醫(yī)院，義烏市3000；.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，徐州市1004）

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥根莖，為常用中藥。藥理實(shí)驗(yàn)已表明地黃對(duì)造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫、抗腫瘤及心血管系統(tǒng)等有著廣泛的生物活性[1]。多糖作為提高機(jī)體免疫功能的保健品已被廣泛開發(fā)，但許多多糖產(chǎn)品僅僅停留在保健品階段，未能開發(fā)成藥物，主要原因是多糖的分離純化困難，技術(shù)不過關(guān)。目前對(duì)地黃多糖的提取及分離純化的研究少見報(bào)道，特別是對(duì)地黃多糖的提取工藝的研究尚未見報(bào)道。為此，筆者對(duì)地黃多糖的提取與純化工藝進(jìn)行了研究，以期為地黃的開發(fā)及綜合利用提供理論依據(jù)及參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-probe型紫外分光光度計(jì)、Shimadu FTIR8300型紅外光譜儀（日本島津公司）；BSZ型自動(dòng)部分收集器（上海滬西分析儀器廠）；電熱恒溫干燥箱（江蘇金壇億通電子有限公司）；層析柱（上海錦華實(shí)驗(yàn)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株氏會(huì)社）；PB203-N型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

將采自河南懷慶的新鮮地黃（由浙江義烏市中心醫(yī)院中藥房鑒定為真品）浸入黃酒，酒液沒過藥面，用小火蒸干藥液后取出曬干制得，將地黃在80℃烘箱中干燥至恒重，粉碎過20目篩，置干燥器中備用；乙醇、苯酚、石油醚、丙酮、正丁醇、濃硫酸、氯化鈉、乙醚、氫氧化鈉等均為分析純；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司，純度＞99%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 地黃粗多糖的提取

取一定量的地黃，依次用石油醚、乙醚除去脂溶性雜質(zhì)，然后用80%的乙醇脫單糖、低聚糖。加10倍量的水90～100℃提取3次，每次3 h，合并水提液，過濾。70℃水浴減壓濃縮至適量，加入5倍量95%的乙醇純析，靜置過夜，離心過濾，真空冷凍干燥，得地黃多糖粗品。

2.2 地黃粗多糖的純化

將地黃粗多糖溶于蒸餾水，去不溶物，按Sevag法（氯仿∶正丁醇＝4∶1）脫蛋白，重復(fù)10次以上，然后移至透析袋中用去離子水逆流透析24 h，直至紫外光譜分析檢測(cè)無蛋白吸收。以氨水調(diào)節(jié)pH值為8，滴加H2O250℃保溫脫色2 h，減壓濃縮，加入5倍量的無水乙醇，靜置過夜，離心收集沉淀，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷凍干燥，得去蛋白地黃粗多糖純品。

2.3 地黃多糖含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.5g，蒸餾水溶解，加入0.25 mL濃硫酸，蒸餾水定容至50 mL，得濃度為1.0 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 純度的鑒定:稱取適量熟地黃多糖，溶于蒸餾水后用紫外分光光度計(jì)在190～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處無吸收峰，表明提取純化的多糖中不含有核酸、蛋白質(zhì)以及其它雜質(zhì)成分。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解后定容，配成濃度為116 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)苯酚-濃硫酸比色法[2]測(cè)定。多糖被濃硫酸水合時(shí)產(chǎn)生的高溫迅速水解生成單糖，該單糖在強(qiáng)酸的條件下與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物，此橙色衍生物在490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，從而確定本研究的最大吸收峰為490 nm。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、30、40、50、60、70、80 μL，分別置于具塞試管中，依次加蒸餾水使其總體積為2.0 mL，分別精密加入5%苯酚試劑1 mL搖勻，迅速精密滴加濃硫酸5 mL，以渦流混懸器快速混勻，放置5 min后置沸水浴中加熱15 min，取出冷至室溫。另以蒸餾水2.0 mL與上述操作同法加入苯酚溶液和濃硫酸，作為空白對(duì)照。將上述各溶液于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，得回歸方程為Y＝0.005 6X+0.436 1（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，葡萄糖進(jìn)樣量在0.003 8～0.307 7 mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn):取27.00 mg地黃粗多糖純品，加蒸餾水溶解并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，為樣品貯備液。取樣品貯備液0.5 mL，置于10 mL具塞試管中，加苯酚試液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻。放置5 min，于沸水浴中加熱15 min，取出，冷卻至室溫。分別在0、1、2、3、4、5 h時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果，平均吸光度為0.327，RSD＝1.23%，表明樣品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 精密度試驗(yàn):按“2.3.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，每份1 mL，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。結(jié)果，地黃多糖的平均含量為0.031 9 mg，RSD＝1.07%，表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一樣品粉末6份，按“2.3.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。結(jié)果，地黃多糖含量的RSD＝1.02%，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn):精密稱取已知含量的地黃粗多糖純品6份，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，按“2.3.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 The results of recovery test（n＝5）

2.3.9 樣品含量測(cè)定:精密稱取地黃粗多糖純品0.5 g，按“2.3.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算地黃粗多糖含量，結(jié)果見表2。

表2 地黃多糖含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content of R.glutinosa

3 討論

多糖總糖含量測(cè)定是多糖提取分離的基礎(chǔ)，一般依靠糖類物質(zhì)的特征顏色反應(yīng)進(jìn)行。就反應(yīng)的化學(xué)過程而言，可以分為兩類，一類是以無機(jī)酸（硫酸或鹽酸）使糖類脫水形成呋喃醛類衍生物，進(jìn)一步與酚類或含氮堿縮合生成有色物質(zhì)；另一類是以堿處理糖類，產(chǎn)生復(fù)雜的裂解衍生物，與某些試劑相作用，呈現(xiàn)特殊顏色。目前常用的多糖分析檢測(cè)方法有苯酚-硫酸、蒽酮-硫酸和3，5-二硝基水楊酸法（簡(jiǎn)稱DNS法）[3]。本試驗(yàn)中，筆者選用了苯酚-硫酸比色法對(duì)地黃粗多糖總糖含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，改進(jìn)后的苯酚-硫酸顯色后在490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。本研究中通過對(duì)苯酚-硫酸法的方法學(xué)考察，表明其方法簡(jiǎn)便易行、快速靈敏、精密度高、顯色穩(wěn)定、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度好，可以作為地黃多糖含量測(cè)定的有效方法。

乙醇作為多糖常用的一種沉降劑，其濃度與提取液的濃縮程度是影響沉降效果的關(guān)鍵因素。醇析時(shí)乙醇濃度過低，溶液中的多糖不能完全沉淀出來，而乙醇濃度過高會(huì)促使溶液中其它成分連同多糖一起析出，乙醇濃度在75%～85%范圍內(nèi)較好。未經(jīng)濃縮的多糖提取液由于多糖含量較低，加入沉降劑后多糖濃度進(jìn)一步下降，不利于多糖沉淀。本研究采用75%乙醇沉淀得到的地黃粗多糖，經(jīng)光譜分析提取率高，其總糖平均含量亦較高。地黃多糖在空氣中提取或干燥時(shí)顏色會(huì)加深，本研究中筆者在地黃多糖提取液除去色素的過程中用1%的活性炭，但在脫色時(shí)活性炭使用量大，樣品損失較多，后改為H2O2，脫色效果較理想，因此筆者采用H2O2脫色工藝。筆者采用Sevage法脫除蛋白質(zhì)的過程中，多糖損失較大，這可能是由于地黃中的多糖主要以糖肽和糖蛋白的形式存在。因此，為解決地黃脫除蛋白過程中多糖的損失尚需進(jìn)一步研究。

[1]劉福君，趙修南，聶 偉，等.地黃低聚糖增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)學(xué)報(bào)，1998，14（1）:90.

[2]邊寶林，王宏潔，倪慕云.地黃及其炮制品中幾種主要糖的含量測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志，1992，20（8）:469.

[3]宋曉勇，劉 強(qiáng)，王子華.蒲公英多糖降糖藥理作用研究[J].中國(guó)藥房，2009，20（27）:2 095.