免疫磁珠捕獲結(jié)合熒光PCR技術(shù)檢測食品中黃曲霉菌的研究

蘇惠玉，謝榮珍，牛建軍

(1.廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建 廈門 361008；2.廈門市疾病預(yù)防控制中心，福建 廈門 361021)

免疫磁珠捕獲結(jié)合熒光PCR技術(shù)檢測食品中黃曲霉菌的研究

蘇惠玉1，謝榮珍2，牛建軍2

(1.廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建 廈門 361008；2.廈門市疾病預(yù)防控制中心，福建 廈門 361021)

目的：研究利用免疫磁珠對食品中黃曲霉菌進(jìn)行捕獲的技術(shù)，為檢測食品中污染的黃曲霉菌提供新方法。方法：應(yīng)用山羊抗黃曲霉菌血清的免疫磁珠捕獲食品中的黃曲霉菌，不需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，應(yīng)用磁捕獲-熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IMC-FPCR)技術(shù)快速檢測鑒定食品中的黃曲霉菌。結(jié)果：IMC-FPCR方法檢測黃曲霉菌的最低檢測值為2CFU/mL。應(yīng)用IMC-FPCR對從市場上購買的12種食品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有兩份樣品含有產(chǎn)毒素相關(guān)基因(即為可能的致癌菌株)，檢出率為16.7%，其中花生中檢出1株黃曲霉菌，面線中檢出1株黃曲霉菌。結(jié)論：建立了黃曲霉菌的磁捕獲-熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IMC-FPCR)方法，該方法可用于食品中黃曲霉菌的快速檢測及鑒定，實(shí)物檢測結(jié)果提示市場上食品有被真菌污染。

黃曲霉菌；免疫磁珠；熒光PCR；快速檢測

一些有害真菌在其生長發(fā)育過程中，可破壞食物結(jié)構(gòu)，造成食物營養(yǎng)損耗，形成有毒有害產(chǎn)物(真菌毒素)，常引起人類的急慢性食物中毒，甚至誘導(dǎo)基因突變和導(dǎo)致惡性腫瘤。產(chǎn)毒真菌在自然界分布廣、數(shù)量大、種類多，每年由此造成的食物損失達(dá)5%～10%[1-3]；產(chǎn)生的真菌毒素大多為分子量較小的有機(jī)化合物，穩(wěn)定性強(qiáng)、毒性大，由真菌毒素污染食物及飼料后，通過直接或間接途徑進(jìn)入人類食物鏈所造成的危害就更難以估計(jì)了[4-5]。在所有真菌中，由黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素的毒性危害最大，致癌力最強(qiáng)，可導(dǎo)致肝癌、胃癌和結(jié)腸癌等，已在糧食、油料作物種子、水果、干果、蔬菜、調(diào)味品、煙草、乳類、乳制品、肉類、魚蝦類、發(fā)酵產(chǎn)品和飼料中均發(fā)現(xiàn)有黃曲霉毒素[1-7]。致癌真菌在自然界分布較廣，常常存在于土壤和其他基質(zhì)中，并能隨之污染糧食、油料作物的種子、食品和飼料等。致癌真菌的存在不僅嚴(yán)重影響人類自身的健康，而且嚴(yán)重危害一個(gè)國家或地區(qū)的食品和飼料行業(yè)的發(fā)展。糧食、食品和飼料一旦被致癌真菌污染，即使未能從樣品中檢出真菌毒素，仍存在導(dǎo)致惡性腫瘤的潛在危險(xiǎn)[6-7]。

對于食品中致癌真菌的研究，國內(nèi)外僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道。如致癌真菌產(chǎn)毒菌株的鑒定多采用待檢菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)后經(jīng)薄層層析法測定其產(chǎn)毒能力，這種方法需要較完善的實(shí)驗(yàn)條件，操作較為繁瑣，所需時(shí)間較長，進(jìn)行大量檢測時(shí)無法滿足需要[6-7]。本研究應(yīng)用山羊抗黃曲霉菌血清和免疫磁珠制備黃曲霉菌免疫磁珠，用于捕獲食品中的黃曲霉菌，不需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，建立黃曲霉菌的磁捕獲-熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IMC-FPCR)快速檢測及鑒定方法，該方法靈敏度高、簡便快速，對于防范及控制真菌性食源性疾病有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米粉、面線、南瓜面、番茄面、貢菊花、紅豆、花生、葡萄干、銀鷺花生牛奶、廈門即食面、大米、花椒12種實(shí)物均購于廈門市。

普通營養(yǎng)肉湯、瓊脂粉 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Power SYBR Green PCR Master Mix 美國Applied Biosystems公司；山羊抗黃曲霉菌IgG UniQ免疫磁珠北京百奧科生物技術(shù)有限公司；乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

黃曲霉GIM3.461(編號AS3.3928)、黃曲霉GIM3.18 (編號IMAS4076)、大腸桿菌GIM1.153(編號0157C83729)廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

察氏瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

REVCO plus-86C型超低溫冰箱 美國Revco公司；1-15K型臺式小型低溫離心機(jī) 美國Sigma公司； 7300型熒光定量PCR儀 美國ABI公司；MPC-S型磁架Dynal Biotech公司。

1.4 方法

1.4.1 真菌培養(yǎng)

無菌稱取實(shí)物樣品25g，加入225mL無菌生理鹽水，均質(zhì)混勻，制備成為10-1、10-2、10-3共3個(gè)梯度的樣品稀釋液，各梯度吸取1mL接種于培養(yǎng)皿，分別使用察氏瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)進(jìn)行培養(yǎng)，且每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行，28℃培養(yǎng)5d，觀察記錄菌落生長狀態(tài)[8-9]。

1.4.2 免疫磁珠捕獲方法的建立

在無菌操作條件下，用移液槍移取1mL以上用察氏液體培養(yǎng)基搖培的黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)液于1.5mL的小管中，利用臺式小型低溫離心機(jī)于10000r/min離心20min，棄液體，沉淀重懸于1.0mL的PBS緩沖液中，再加入0.1mL的免疫磁珠懸液，室溫下于搖床上100r/min輕緩旋轉(zhuǎn)30min，完成后再將小管置于磁架上5min，在磁架上小心地移出管中液體，取出小管加入1mL PBST洗液，混勻，置于磁場架上5min，再移出洗液，重復(fù)清洗3次，移出洗液后再加入0.1mL的PBS重懸液，使吸附黃曲霉菌的磁珠重懸其中，將一部分帶有黃曲霉菌的磁珠懸液的小管倒入已經(jīng)過高溫滅菌過的培養(yǎng)皿中，再倒入冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基，混勻，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[10-11]。

1.4.3 IMC-FPCR檢測黃曲霉菌

采用液氮研磨的方法破壁，用CTAB方法(100μL CTAB提取液[10-11]：質(zhì)量濃度2mg/100μL CTAB，1.4mol/L NaCl溶液，體積分?jǐn)?shù)0.2% β-巰基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl、pH8.0)提取已破壁的菌體DNA。針對免疫磁珠捕獲分離的真菌，以標(biāo)準(zhǔn)菌株黃曲霉為陽性對照，大腸桿菌為陰性對照，以無菌水為空白對照，20μL PCR體系為2×Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL、20mmol/L正反向引物各0.5μL、DNA 2μL、無菌水7μL。熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0℃反應(yīng)2min；95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃反應(yīng)1min，40個(gè)循環(huán)；同時(shí)在熒光PCR儀上設(shè)置記錄60℃到95℃的熔解曲線。正反向引物依據(jù)黃曲霉和寄生曲霉的產(chǎn)毒相關(guān)基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)，具體序列如下：Afa-F(5'-C G T T G G C G C G C T T G T T A C-3')，A f a-R(5'-CGCCCCGATCATTATTTACG-3')，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.4 IMC-FPCR檢測靈敏度

吸取0.5mL黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌液于4.5mL的無菌水，依次類推分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度水平，取稀釋度的菌液各1mL，按前述方法進(jìn)行免疫磁捕獲和熒光PCR檢測；另取稀釋度的菌液各1mL接種于PDA培養(yǎng)基，于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[10-11]。

1.4.5 IMC-FPCR法檢測實(shí)物樣品

無菌稱取樣品25g，加入225mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)混勻，取1mL于1.5mL的離心管中，經(jīng)1500r/min離心3min使非菌體固形物沉淀，吸取上清液(含有未能沉淀的菌體)棄沉淀(實(shí)物中的固形物)，于10000r/min離心20min，棄上清液，加入1.0mL的PBS緩沖液，懸浮沉淀的菌體，混勻，再加入0.1mL的免疫磁珠懸液，室溫下于搖床上100r/min輕緩旋轉(zhuǎn)30min使菌體結(jié)合吸附于免疫磁珠上，完成后再將小管置于磁架上5min，在磁架上小心地移出管中液體，取出小管加入1mL PBST洗液混勻，置于磁架上5min，移出洗液，重復(fù)清洗3次，

移出洗液后再加入0.1mL的PBS重懸液使吸附黃曲霉菌的磁珠重懸其中。重懸液按1.4.3節(jié)方法進(jìn)行樣品DNA的提取，然后利用熒光PCR進(jìn)行檢測，并用黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照、大腸桿菌作陰性對照、水作空白對照[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品中真菌的培養(yǎng)結(jié)果

從食品中培養(yǎng)得到的真菌見圖1，在培養(yǎng)基上的菌落特征為圓形凸翹，表面黃色，氈狀，邊緣不規(guī)則。

圖1 食品中真菌的察氏平板培養(yǎng)情況Fig.1 Growth status on Czapek's plate of the fungal stain isolated from commercial foods tested

2.2 免疫磁珠捕獲目的菌結(jié)果

以黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為測試菌株，應(yīng)用制備的黃曲霉免疫磁珠捕獲目的菌，并在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果見圖2。菌落長勢良好。大小為3～6cm，菌落呈圓形，表面黃色，氈狀，邊緣不規(guī)則。

圖2 利用免疫磁珠捕獲并在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的黃曲霉菌GIM3.461Fig.2 Growth status on PDA plate of Aspergillus flavus reference strain captured with the immunomagnetic beads coated with goat antiserum against Aspergillus flavus

2.3 熒光PCR法檢測目的菌結(jié)果

以黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為測試菌，應(yīng)用制備的黃曲霉免疫磁珠捕獲目的菌，并采取反復(fù)凍融破壁和煮沸法獲取黃曲霉菌的DNA，并利用熒光PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。通過觀察PCR擴(kuò)增的曲線圖和PCR反應(yīng)的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)來判斷菌株的致癌性(以Ct值小于29為陽性，大于29或“不能檢出”為陰性來進(jìn)行判斷)，對兩株黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均顯示陽性結(jié)果，同時(shí)對空白對照(水)和大腸桿菌均顯示陰性結(jié)果。擴(kuò)增結(jié)果的熔解曲線如圖4所示，兩株黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌的擴(kuò)增產(chǎn)物均在83℃左右出現(xiàn)單一的熔解峰，而陰性對照和空白對照的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒有出現(xiàn)熔解峰，表明了反應(yīng)的特異性很高。兩種標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉菌株(黃曲霉GIM3.461；黃曲霉GIM3.18)在方法建立過程中結(jié)果一致，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用了GIM3.461作為陽性對照。

圖3 利用熒光PCR對黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增的曲線圖Fig.3 Real-time PCR amplification curves of Aspergillus flavus reference strains GIM 3.461 and 3.18 and Escherichia coli GIM 1.153

圖4 黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線Fig.4 Melting curves of real-time PCR amplification products from Aspergillus flavus reference strains GIM 3.461 and 3.18 and Escherichia coli GIM 1.153

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 IMC-FPCR應(yīng)用于檢測梯度稀釋的黃曲霉GIM3.461的結(jié)果Fig.5 Real-time PCR amplification curves obtained in the detection of gradient dilutions of Aspergillus flavus reference strain GIM 3.461 by the IMC-FPCR assay

表1 梯度稀釋的黃曲霉菌GIM3.461利用熒光PCR擴(kuò)增的Ct值Table 1 Ct values of real-time PCR amplification products of gradient dilutions of Aspergillus flavus reference strain GIM 3.461

標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉菌經(jīng)28℃培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度3個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，其中稀釋度為10-5的黃曲霉菌數(shù)為92CFU/mL，稀釋度為10-6的菌數(shù)為9CFU/mL，稀釋度為10-7的菌數(shù)為2CFU/mL，而熒光PCR的檢測結(jié)果見圖5和表1，對10-1～10-7倍稀釋菌液檢測均顯示陽性，對10-8和10-9倍稀釋菌液檢測顯示陰性，因此，IMC-FPCR方法檢測黃曲霉菌的最低檢測值為1CFU/mL。擴(kuò)增產(chǎn)物在85℃左右有熔解峰，并且只有單一的熔解峰，表明反應(yīng)的特異性很高。

2.5 IMC-FPCR法檢測實(shí)物樣品結(jié)果

圖6 IMC-FPCR應(yīng)用于檢測實(shí)物樣品中黃曲霉菌試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Real-time PCR amplification curves obtained in the detection of Aspergillus flavus in 3 real food samples by the IMC-FPCR assay

圖7 利用熒光PCR對實(shí)物樣品進(jìn)行擴(kuò)增的熔解曲線Fig.7 Melting curves of real-time PCR amplification products from Aspergillus flavus in 3 real food samples

在確立了黃曲霉菌免疫磁珠捕獲黃曲霉菌以及熒光PCR檢測的基礎(chǔ)上，將隨機(jī)從市場和超市采集的米粉、面線、南瓜面、番茄面、貢菊花、紅豆、花生、葡萄干、銀鷺花生牛奶、廈門即食面、大米、花椒1 2種實(shí)物樣品，以IMC-FPCR方法進(jìn)行黃曲霉菌檢測，其中以Ct值小于29為陽性，大于29、Undet為陰性來進(jìn)行判斷，結(jié)果見圖6和表2。從12份受檢樣品中分離出24份樣品液，其中有兩份樣品檢測為陽性，檢出率為16.7%。其中花生中檢測出含有1株黃曲霉菌，面線中檢測出有1株黃曲霉菌。由圖7可知，擴(kuò)增產(chǎn)物在85℃左右有熔解峰，并且只有單一的熔解峰，表明了反應(yīng)的特異性很高。

表2 實(shí)物樣品利用熒光PCR擴(kuò)增的Ct值Table 2 Ct values of real-time PCR amplification products from Aspergillus flavus in real food samples

3 結(jié) 論

本研究建立了利用免疫磁珠對食品中黃曲霉菌進(jìn)行捕獲并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(IMC-FPCR)。免疫磁珠法是基于抗原抗體反應(yīng)和磁分離技術(shù)，將制備好的黃曲霉菌免疫磁珠直接加至檢樣中，黃曲霉菌將被吸附在磁珠的抗體上，在磁場的作用下與其他微生物和樣品殘?jiān)蛛x開來，從而直接捕獲檢樣中的黃曲霉菌，不需要增菌培養(yǎng)，經(jīng)熒光PCR檢測證實(shí)，免疫磁珠從檢樣中直接分離和富集真菌，該方法簡便、快速、可實(shí)現(xiàn)大批量檢測[10-11]。敏感度是檢測方法是否成熟有效的

重要指標(biāo)[13-14]，本實(shí)驗(yàn)以黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照、大腸桿菌作陰性對照、水作空白對照進(jìn)行了多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定了Ct值陽性、陰性判斷界限值取29，小于29為陽性，大于29或“不能檢出”為陰性的判定標(biāo)準(zhǔn)，以及IMC-FPCR法對黃曲霉菌的檢測低限為2CFU/mL。結(jié)果表明，建立的IMC-FPCR法抗干擾性強(qiáng)，免疫磁珠方法直接從檢樣中捕獲靶物質(zhì)，去除了PCR抑制物；同時(shí)由于熒光PCR特異性擴(kuò)增黃曲霉菌DNA，免疫磁珠吸附的包括黃曲霉菌在內(nèi)的其他細(xì)菌不會干擾熒光PCR，IMC-FPCR解決了干擾及抑制問題。對12種食品檢樣利用IMC-FPCR方法進(jìn)行檢測，其中有兩份樣品檢出被真菌污染，還提示了市場上食品可能存在被真菌污染的現(xiàn)象。

本研究在分析比較真菌產(chǎn)毒素相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，依據(jù)黃曲霉毒素相關(guān)基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了檢測黃曲霉菌基因的引物，應(yīng)用山羊抗黃曲霉菌血清和免疫磁珠制備黃曲霉菌免疫磁珠，用于捕獲食品中的黃曲霉菌，不需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，建立了黃曲霉菌的磁捕獲-熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速檢測及鑒定方法。該方法靈敏度高、選擇性好、簡便，可在一個(gè)工作日內(nèi)完成檢測。

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Immunomagnetic Capture-Fluorescent PCR (IMC-FPCR) for Rapid Detection of Aspergillus flavus in Foods

SU Hui-yu1，XIE Rong-zhen2，NIU Jian-jun2
(1. Xiamen Medical College, Xiamen 361008, China；2. Center for Disease Prevention and Control of Xiamen City, Xiamen 361021, China)

An immunomagnetic bead based technique combined with fluorescent PCR assay was developed for the detection of Aspergillus flavus in foods. Aspergillus flavus in foods could be captured with the immunomagnetic beads coated with goat antiserum against Aspergillus flavus without the requirement for fungal enrichment and rapidly detected by fluorescent PCR assay. The IMC-FPCR assay exhibited a limit of detection of 2 CFU/mL. Two of 12 commercial food samples were detected by the IMC-FPCR assay to contain toxin genes from carcinogenic fungal strains and the detection rate was 16.7% and one Aspergillus flavus strain was detected in peanut and Xiamen ready-to-eat noodles, respectively. This assay is most suitable for the rapid detection of Aspergillus flavus in foods.

Aspergillus flavus；immunomagnetic beads；fluorescent PCR；rapid detection

TS207.4

A

1002-6630(2010)10-0287-05

2010-02-15

廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20064028)

蘇惠玉(1964—)，女，講師，本科，主要從事醫(yī)學(xué)護(hù)理研究。E-mail：chn@jmu.edu.cn