高效液相色譜法同時(shí)檢測糧谷中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素

楊 琳，張宇昊,2，馬 良,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

高效液相色譜法同時(shí)檢測糧谷中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素

楊 琳1，張宇昊1,2，馬 良1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

建立糧谷類食品中黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)和赭曲霉毒素A的同時(shí)檢測方法。樣品經(jīng)過甲醇-水(80:20，V/V)提取，液液萃取凈化和富集后，三氟乙酸衍生，采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6mm× 250mm)，以乙腈和體積分?jǐn)?shù)2%冰醋酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，在線變換波長熒光檢測。根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值，確定黃曲霉毒素(B1、B2、G1和G2)和赭曲霉毒素A檢出限分別為0.06、0.03、0.18、0.05μg/kg和0.51μg/kg，上述5種毒素分別在質(zhì)量濃度0.05～100、0.125～25.00、0.05～100、0.125～25.00μg/L和0.05～50.00 μg/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.9998、0.9998、0.9998、0.9996和0.9998；在玉米、大米、小麥3類樣品中加標(biāo)回收率平均為71.73%～115.37%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.00%～9.88%，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A 5種毒素同時(shí)檢測結(jié)果與現(xiàn)行國標(biāo)的單獨(dú)檢測方法檢測結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)。

高效液相色譜；真菌毒素；同時(shí)檢測；糧谷

黃曲霉毒素(AFT)和赭曲霉毒素(OT)是真菌毒素中毒性最大的兩類毒素[1]，1993年AFT被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為一類致癌物，赭曲霉毒素中的赭曲霉毒素A (OTA)則被列為二類致癌物。AFT和OT不僅毒性強(qiáng)，而且污染范圍極廣，AFT對糧食和飼料的危害有不少報(bào)道，檢出率高達(dá)80%～100%[2-3]，OT則被許多國家檢出大量污染糧食作物[4-6]，更有資料表明AFT和OTA常常同時(shí)污染同一糧食作物[7]，而且存在毒性的加性效應(yīng)[8]。目前雖然AFT和OTA的分別測定方法已比較成熟，很多學(xué)者都做了大量的研究，但其分別測定成本較高，試劑損耗嚴(yán)重且測定耗時(shí)，工作量大。而對AFT和OT進(jìn)行同時(shí)檢測可有效解決上述問題，縮短分析時(shí)間，提高食品安全性。目前對食品、農(nóng)產(chǎn)品中AFT和OT等真菌毒素的單獨(dú)檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光光度法、膠體金免疫層析法和高效液相色譜法等[9]，但對其進(jìn)行同時(shí)檢測的報(bào)道較少，雖有少數(shù)文獻(xiàn)建立了其同時(shí)檢測方法[10-16]，但其方法成本高，設(shè)備昂貴，不能在一般實(shí)驗(yàn)室大面積推廣使用，因而受到限制，本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取凈化-三氟乙酸柱前衍生-高效液相色譜法配制可變波長熒光檢測器同時(shí)檢測AFT和OTA，可為糧食中AFT和OTA的限量檢測提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

玉米、大米、小麥均購于超市，產(chǎn)于重慶地區(qū)。

乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、正己烷(分析純) 天津四友公司；冰醋酸(色譜純)、三氟乙酸(分析純) 成都科龍?jiān)噭S；AF(B1、B2、G1和G2)和OTA標(biāo)準(zhǔn)品北京泰樂祺公司；高純氮?dú)?重慶嘉潤氣體有限公司；超純水。

LC-20A高效液相色譜儀(配有可變波長熒光檢測器)日本島津公司；JY2002分析天平(精度到0.0001g) 上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠；KQ-50超聲清洗器昆山超聲儀器有限公司；HQ-60漩渦振蕩器 北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司；SG-280萬能高速粉碎機(jī) 天津達(dá)康公司；HGC-12A氮吹儀 南京科捷分析儀器廠；JSG22 ×12標(biāo)準(zhǔn)篩 杭州大吉光電儀器有限公司；TC-M160 AFT多功能凈化柱、OTA-A01免疫親和柱 北京泰樂祺公司；Milli-QA10System超純水儀 Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 同時(shí)檢測方法

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取0.0010g AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA溶于1mL乙腈中，配制成各自質(zhì)量濃度為106μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封后避光保存。用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱，4.6mm ×250mm；流動(dòng)相A：2%冰醋酸-乙腈70:30(V/V)；流動(dòng)相B：2%冰醋酸-乙腈 50:50(V/V)；流速：1mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相梯度洗脫條件Table 1 Elution conditions of HPLC

1.2.1.3 提取與凈化

樣品粉碎，過20目篩，準(zhǔn)確稱取5g樣品于50mL三角瓶中，加入20mL甲醇-水(80:20，V/V)，室溫超聲提取20min，定量濾紙過濾至三角瓶中，準(zhǔn)確移取濾液5mL于試管中，加入5mL三氯甲烷，振蕩1min，靜置分層，將上層濾液移入另一試管中，向其加入1mL三氯甲烷，振蕩1min，靜置分層，棄去上層水層，將三氯甲烷層倒入第一支試管中，合并兩次萃取液。

1.2.1.4 衍生

將收集到的萃取液(60±1)℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?00μL正己烷和100μL三氟乙酸，密閉混勻30s，(40± 1)℃烘干箱中衍生15min，室溫水浴氮?dú)獯蹈?，?mL流動(dòng)相溶解，0.22μm有機(jī)濾膜過濾，液相色譜測定。

1.2.2AFT國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法

參照GB/T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》[17]方法檢測。

1.2.3 OTA國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法

參照GB/T 23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的測定：免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[18]方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取凈化條件的選擇

2.1.1 提取方式對毒素提取效果的影響

圖1 提取方式對毒素回收率影響Fig.1 Effect of extraction method on recovery rates of mycotoxins

實(shí)驗(yàn)比較超聲波和漩渦振蕩及兩者交替3種方式對提取效果的影響，3種方式對毒素的提取回收率影響見圖1。結(jié)果表明超聲波提取效果比漩渦振蕩效果好，各種毒素的回收率均在80%以上，而漩渦提取回收率不到70%，超聲與漩渦交替與直接超聲提取結(jié)果無顯著差異。

在食品原料中，毒素在食品中的分布非常不均勻，毒素并不集中在樣品顆粒表面，而是常常包埋在種子內(nèi)部，并且與某些成分結(jié)合在一起，加之含量甚微，所以采用普通的機(jī)械振蕩處理很難提取完全，而超聲波提取技術(shù)主要通過快速機(jī)械振動(dòng)波來減少目標(biāo)萃取物與樣品基體之間的作用力從而實(shí)現(xiàn)固-液萃取分離，從而使固體樣品分散，被提取的樣品細(xì)胞在瞬間破碎，同時(shí)改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，從而加強(qiáng)了毒素的溶解及擴(kuò)散，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率，所以有利于毒素的提取完全。故采用超聲波作為提取方式。

2.1.2 提取溶劑對毒素提取效果的影響

分別以甲醇-水(90:10；80:20；70:30，V/V)和乙腈-水(90:10；80:20；70:30，V/V)為提取劑對樣品進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以甲醇-水(80:20，V/V)和乙腈-水(80: 20，V/V)的提取效率最高，回收率均大于85%，提取結(jié)果見圖2。

圖2 提取劑比例對毒素回收率的影響Fig.2 Effect of solvent amount on recovery rates of mycotoxins

AFT和OTA易溶于帶極性的溶劑而不溶于非極性溶劑中，一般使用幾種有機(jī)溶劑的混合液，如甲醇、乙睛、丙酮、氯仿等作為提取液。提取液中少量水可以濕潤基質(zhì)，增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力，提高萃取效率，因此，通常采用有機(jī)溶劑與水的混合溶液作提取劑，例如，氯仿-水、甲醇-水或乙睛-水等；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明80%甲醇溶液和80%乙腈溶液對提取效果影響無顯著差異，考慮到甲醇的潛在毒性相對較低且價(jià)格便宜，因此最終選擇以甲醇-水(80:20，V/V)作為提取劑。

2.1.3 提取時(shí)間對毒素提取效果的影響

研究提取時(shí)間(10、20、30min)對提取率的影響，當(dāng)提取時(shí)間10min時(shí)各種毒素回收率較低，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)20min以上時(shí)，回收率顯著升高，20min和30min對提取效果無顯著差異，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對毒素回收率的影響Fig.3 Effect of extraction time on recovery rates of mycotoxins

隨超聲波提取時(shí)間的延長，提取率增大。分析原因是毒素在甲醇-水溶液中擴(kuò)散逐漸均勻，隨著時(shí)間延長而達(dá)到最大溶解度；但是提取時(shí)間過度延長，使雜質(zhì)的溶出量增加，使毒素的檢測受到干擾，另一方面成本費(fèi)用增大，影響環(huán)保，因此提取時(shí)間確定為20min。

2.1.4 萃取次數(shù)對毒素提取效果的影響

研究萃取次數(shù)(1、2次和3次)對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)2次以上時(shí)提取效果較好，回收率均大于80%，結(jié)果見圖4。

圖4 萃取次數(shù)對毒素回收率的影響Fig.4 Effect of extraction repeat number on recovery rates of mycotoxins

AFT和OTA易溶于甲醇、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，當(dāng)用三氯甲烷萃取1次時(shí)仍有少量毒素殘留水相中，回收率低，當(dāng)萃取2次后回收率顯著升高，毒素已基本萃取完全，萃取2次和萃取3次結(jié)果無顯著差異，因此最終選擇萃取2次。

2.1.5 提取溫度、功率和料液比對毒素提取效果的影響

研究溫度(40、30、20℃)、功率(100、120、150W)、料液比1:4、1:5、1:6(g/mL)對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)三者對提取率的影響不顯著，本著經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的原則最終選擇20℃、100W和料液比1:4(g/mL)作為提取條件。

2.2 線性范圍及檢出限

分別用AFB1、AFG1、AFB2、AFG2和OTA的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按選定的色譜條件測定，其質(zhì)量濃度(y)與峰面積(x)具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值，得出此方法檢出限。

表2 真菌毒素的線性回歸方程及檢出限Table 2 Regression equations and detection limits of mycotoxins

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別用同一批樣品做了日內(nèi)和日間7次精密度實(shí)驗(yàn)，日內(nèi)不同時(shí)間段分別處理7個(gè)樣品，日間連續(xù)7d每天處理一個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。日內(nèi)和日間實(shí)驗(yàn)都表明精密度良好，說明方法重現(xiàn)性好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of precision experiments

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

在玉米、大米和小麥中添加表4中所列的3組不同水平的真菌毒素，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，測得的回收率見表4。標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)樣品的色譜圖見圖5～8。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery experiments

圖6 玉米樣品液相色譜圖Fig.6 Chromatogram of corn sample

圖7 大米樣品液相色譜圖Fig.7 Chromatogram of rice sample

表6 本方法與國標(biāo)方法比較Table 6 Comparison of the simultaneous determination method with current national standard method

圖8 小麥樣品液相色譜圖Fig.8 Chromatogram of wheat sample

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

將所建立的AFT和OTA 5種主要真菌毒素同時(shí)檢測方法與AFT、OTA單一毒素國標(biāo)檢測方法進(jìn)行比對，同一批樣每種方法平行測定3次，比對結(jié)果見表5。

表5 與國標(biāo)對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Comparison of experimental results with current national standard

本方法在試劑使用、時(shí)間、成本及檢出限等方面都滿足現(xiàn)行國標(biāo)要求，比較結(jié)果見表6。

從表6可以看出，AFT和OTA的同時(shí)檢測可以節(jié)約時(shí)間，降低成本，減少工作量，避免試劑的重復(fù)使用，檢出限滿足國家檢測標(biāo)準(zhǔn)要求，適用于糧食作物中AFT和OTA的測定。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明采用三氟乙酸柱前衍生-高效液相色譜能夠同時(shí)檢測AFT和OTA，且建立的同時(shí)檢測方法與兩者單獨(dú)國標(biāo)檢測方法檢測結(jié)果無顯著差異，該方法成本較低，操作簡便、快速、凈化效果好，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合真菌毒素國家檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求，可以滿足我國對糧食中AFT和OTA的限量檢測要求。

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Simultaneous Determination of Aflatoxins and Ochratoxin A in Cereal Grains by High Performance Liquid Chromatography

YANG Lin1，ZHANG Yu-hao1,2，MA Liang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Special Food Engineering Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

A HPLC method was developed for the simultaneous determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 and ochratoxin A in cereal grains. Cereal grain samples were subject to extraction using methano1-water (80:20, V/V), liquid-liquid purification, enrichment and derivation using trifluoroacetic acid. The purification was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm × 250 mm) with a linear gradient elution of acetonitrile-2% glacial acetic acid. The detection limits of developed HPLC method for AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and OTA were 0.06, 0.03, 0.18, 0.05μg/kg and 0.51μg/kg, respectively. The linear detection ranges of developed HPLC method for AFB1, AFB2, AFG1, AFG2and OTA was 0.05-100, 0.125-25.00, 0.05-100, 0.125-25.00μg/L and 0.05-50.00μg/L with correlation coefficients of 0.9998, 0.9998, 0.9998, 0.9996 and 0.9998, respectively. Recovery rates in cereal grains (corn, rice, wheat) spiked with mycotoxins were in the range of 71.73%-115.37% with the relative standard deviation of 3.00%-9.88%. This HPLC method exhibited the capability to simultaneously determinate mycotoxins. Moreover, no significant difference was observed between the determination results and current national standard (P＞0.05).

high performance liquid chromatography；mycotoxins；simultaneous determination；cereal grain

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0250-05

2010-09-20

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z427)；重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(CSTC，2009AC0008)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK 2009C056)；重慶市高等教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目(09-3-183)；西南大學(xué)“518”質(zhì)量工程項(xiàng)目(2008JY069)

楊琳(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：swuyanglin@yahoo.com.cn

*通信作者：馬良(1979—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)與食品質(zhì)量控制。E-mail：zhyhml@163.com