響應(yīng)面法優(yōu)化雄烯二酮生物轉(zhuǎn)化法工藝

楊 英，姜紹通，劉 模

(1.安徽建筑工業(yè)學(xué)院環(huán)境工程系，安徽 合肥 230022；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

響應(yīng)面法優(yōu)化雄烯二酮生物轉(zhuǎn)化法工藝

楊 英1,2，姜紹通2，劉 模2

(1.安徽建筑工業(yè)學(xué)院環(huán)境工程系，安徽 合肥 230022；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

在已有的雄烯二酮(AD)微生物轉(zhuǎn)化法單因素試驗最適條件基礎(chǔ)上，采用均勻試驗設(shè)計在多項影響植物甾醇轉(zhuǎn)化制備AD的因素中，有效篩選出主效因素：底物濃度、植物油、廢糖蜜。再利用響應(yīng)面分析法(RSM)對以上3個顯著因子的最佳水平范圍進(jìn)行研究，并建立響應(yīng)面及等高曲線圖，比較分析了各主要因子間交互規(guī)律。通過對二次多項回歸方程求解，得到生物轉(zhuǎn)化法最適條件為廢糖蜜58.49mL/L、葵花油211.63mL/L、甾醇6.01g/L，結(jié)合均勻試驗最適條件：硝酸氨3.2g/L、磷酸二氫氨0.8g/L、氯化汞0.055g/L進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實驗，得到AD產(chǎn)量達(dá)到2.55g/L，且重復(fù)性實驗結(jié)果較好。

雄烯二酮；生物轉(zhuǎn)化；均勻設(shè)計；響應(yīng)面分析法；優(yōu)化

甾體化合物是一類含有環(huán)戊烷多氫菲核的化合物，對機(jī)體起著非常重要的作用，被譽為“生命的鑰匙”[1-2]。雄烯二酮(AD)是甾體激素類藥物不可替代的中間體，幾乎所有甾體激素類藥物都是以其作為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的[3]。目前我國生產(chǎn)AD主要是從野生中藥材“穿地龍”等植物中提取薯蕷皂甙元經(jīng)化學(xué)合成而成，不僅工藝十分復(fù)雜，消耗成本很高，而且污染環(huán)境。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，原材料采用生產(chǎn)VE或豆油的副產(chǎn)品甾醇，糖蜜和其他常規(guī)的發(fā)酵用化工產(chǎn)品，利用生物降解甾醇側(cè)鏈，轉(zhuǎn)化得到甾體藥物的這一關(guān)鍵中間體[4-5]。我國是油料生產(chǎn)大國，油脂工業(yè)副產(chǎn)物中蘊藏著極為豐富的植物甾醇資源。長期以來，這些下腳料沒有得到很好的利用，有些甚至被當(dāng)作廢物丟棄，這無疑是對自然資源的極大浪費。由此可見，在我國建立以甾醇為原料的新甾體醫(yī)藥工業(yè)，從長遠(yuǎn)來看，不僅可促進(jìn)制藥工業(yè)的發(fā)展，也會帶動其他工業(yè)的發(fā)展；不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)效益，也具有明顯的社會效益。

雄烯二酮生物轉(zhuǎn)化法與一般的抗生素和氨基酸的轉(zhuǎn)化過程不同，這一過程的產(chǎn)物并不是微生物的初級或者次級代謝產(chǎn)物，而只是通過多酶體系的作用，將植物甾醇的側(cè)鏈切除后轉(zhuǎn)化而成的。因此，其轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的成分除了維持其生長之外，還必須能夠促進(jìn)微生物產(chǎn)生將植物甾醇轉(zhuǎn)化為AD的酶或酶系。本實驗轉(zhuǎn)化菌分枝桿菌屬于化能異養(yǎng)型微生物，其營養(yǎng)要求復(fù)雜，除了需要可轉(zhuǎn)化碳水化合物外，還必須提供維生素、氨基酸等多種生長因子才能正常生長。而且所用菌株是經(jīng)過60Co誘變的突變株，要想其轉(zhuǎn)化性能得到充分的發(fā)揮，必須創(chuàng)造一個適合突變株充分表達(dá)的環(huán)境[6-8]。因此，了解轉(zhuǎn)化工藝條件對轉(zhuǎn)化過程的影響，掌握菌種的生理代謝和過程變化規(guī)律，可以更有效地控制微生物的生長和產(chǎn)物的生成。在轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化方面，通常用于優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件的統(tǒng)計方法如逐因子試驗、全因子試驗等，由于因子較多需要海量次數(shù)試驗[9]。均勻試驗是只考慮試驗點在試驗范圍內(nèi)均勻分布的一種多因素、多水平的試驗方法，試驗次數(shù)只要等于因素的水平數(shù)，既可從眾多的影響因素中快速、有效地獲得期望的結(jié)果供進(jìn)一步研究。響應(yīng)面分析法(response surfacemethodology，RSM)系采用多元二次回歸方法建立連續(xù)變量曲面模型，快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[10]。將多因子試驗中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項式近似擬合，依此可對函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系[11]，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[12-13]。本研究在雄烯二酮微生物法單因素試驗最適條件的基礎(chǔ)上，采用均勻試驗設(shè)計在6項影響植物甾醇轉(zhuǎn)化制備AD的因素中，有效篩選出主要因素：底物濃度、植物油、廢糖蜜。再利用響應(yīng)面分析法對以上3個條件進(jìn)行優(yōu)化，擬合出生物轉(zhuǎn)化法最適條件，并建立響應(yīng)面及等高曲線圖描述各因子間交互規(guī)律，最后通過實驗驗證獲得最佳優(yōu)化條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌種來源：Mycobacterium sp-UV-8 合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院保藏。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(色譜純) Sigma公司；其余試劑均為分析純。

YJ601型電子天平 上海民橋精密儀器有限公司；YJ型超凈工作臺 蘇州市百神科技有限公司；GC-MSQP2010W/ORP230型氣象色譜儀 日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物雄烯二酮的測定

采用氣相色譜定量檢測AD含量。色譜條件：色譜柱為AC-5(30m×0.25mm，0.25μm)；載氣為N2，載氣流速1mL/min，柱溫280℃，進(jìn)樣口溫度280℃，F(xiàn)ID檢測器溫度300℃。

樣品處理：以乙酸乙酯:發(fā)酵液=1:1(V/V)比例提取發(fā)酵液。振蕩10min，至充分溶解后，靜置分層。5000r/ min離心10min，取上層清液，稀釋100倍，作為待測樣品。進(jìn)樣量為1μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：采用外標(biāo)法進(jìn)行AD含量測算?；貧w方程為y=1×106x-1948.9(y為峰面積，x為AD質(zhì)量濃度/(g/L)，線性范圍為0.003～0.300g/L，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化均勻試驗設(shè)計

在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，安排均勻試驗設(shè)計篩選影響AD轉(zhuǎn)化的主要因素，共6個因素11個試驗點。

1.2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基

根據(jù)Plackett-Burman中心組合設(shè)計原理(central composite design，CCD)，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，由均勻試驗設(shè)計確定的3個重要因素各取3水平，設(shè)計了3因素3水平23個試驗點的響應(yīng)面分析并驗證方程的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻試驗設(shè)計優(yōu)化轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取葵花油X1、廢糖蜜X2、甾醇X3、磷酸二氫氨X4、氯化汞X5、硝酸氨X6為考察因素，以AD含量作為考察指標(biāo)，安排均勻試驗設(shè)計篩選影響AD轉(zhuǎn)化的主要因素。共有11個試驗點，11個水平，6個因素，試驗設(shè)計見表1。

表1 均勻試驗設(shè)計U11(1116)Table 1 Factors and levels of uniform design

使用逐步回歸方法(stepwise)進(jìn)行分析，顯著性水平α＝0.15，引入變量的臨界值Fa＝2.723，剔除變量的臨界值Fe＝2.613。

擬建立回歸方程：

逐步回歸變量篩選結(jié)果如下：

表2 殘差分析Table 2 Analysis of remnant difference

表3 優(yōu)化試驗條件Table 3 Optimization of experimental conditions

殘差分析見表2。優(yōu)化的試驗條件見表3。根據(jù)以上分析結(jié)果，最優(yōu)條件為葵花油200mL/L、甾醇6.0g/L、硝酸氨3.2g/L，根據(jù)均勻試驗設(shè)計表1的結(jié)果確定，廢糖蜜X2、磷酸二氫氨X4、氯化汞X5分別限定為54mL/L、0.8g/L、0.055g/L。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

在均勻分析結(jié)果基礎(chǔ)上，將考慮采用二次回歸旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計，按照表4設(shè)計進(jìn)行試驗，三因素五水平的響應(yīng)面分析共有23個試驗點，見表5。

表4 中心組合試驗設(shè)計Table 4 Central composite design

表5 響應(yīng)面分析試驗方案及結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiments

2.3 回歸模型的建立與檢驗

表6 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model for quadratic response surface

使用SASORSystemfor Windows 9.0(簡體中文)試驗版軟件，自編程序。響應(yīng)面分析由RSREG Procedure完成，二次多項式回歸優(yōu)化和分析由GLM Procedure完成，響應(yīng)曲面圖由G3D Procedure完成，等高線圖由Gcontour Procedure完成。數(shù)學(xué)模型的優(yōu)化中，對復(fù)相關(guān)系數(shù)R＞0.75、P＜0.25的各項予以保留[14]。該響應(yīng)面法分析是基于考慮一次相、平方相、及交互相進(jìn)行多元線性回歸，方程如下：

響應(yīng)面分析試驗方案及結(jié)果見表5，其中1～14為二次旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計，15～23為重復(fù)試驗點，用于失擬檢驗。利用SAS RSREG Procedure對試驗數(shù)據(jù)(表6)進(jìn)行分析，得到回歸模型(式2)如下：

模型方差分析表明，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平(P＜0.0001)，逐項顯著性檢驗結(jié)果表明，除Z、WZ、XW的F＜F0.01(9,13)=4.19以外，一次項、交互項、二次項對試驗結(jié)果均有顯著性影響，達(dá)到極顯著性水平。影響生物轉(zhuǎn)化甾醇的影響因素按影響大小分別為W＞X＞Z，其中W極顯著，X影響顯著，Z影響不顯著。

2.4 失擬性檢驗

重復(fù)試驗的平方和：SSLf=∑yi02-(∑yi)2/9=0.038422，自由度：8。

擬平方和：SSel=0.064266；自由度：5。

圖1 廢糖蜜與甾醇交互作用對雄烯二酮產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot for the effect of cross-interaction between molasses and phytosterol on the bioconversion rate at sunflower level of 200 mL/L

圖2 甾醇與葵花油交互作用對雄烯二酮產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface plot for the effect of cross-interaction between phytosterol and sunflower oil on the bioconversion rate at molasses level of 54 mL/L

圖3 廢糖蜜與葵花油交互作用對雄烯二酮產(chǎn)量影響響的應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot for the effect of cross-interaction between molasses and sunflower oil on the bioconversion rate at phytosterol level of 6 g/L

模型失擬FLf=2.676208＜F0.1(5,8)=2.73不顯著，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結(jié)果[15]。

圖1～3是響應(yīng)面三維圖及等高線圖。從圖1可看出，甾醇和廢糖蜜交互作用對方程影響不顯著，最大值均在0水平附近，圖2表明甾醇與葵花油的交互作用對方程影響顯著，分析原因主要為：甾醇為疏水性化合物不溶于水，如將其直接加入到水溶液培養(yǎng)基中很難被微生物有效利用。而添加葵花油大大提高了甾醇的溶解度，同時減小了底物對產(chǎn)物的抑制，因此交互作用顯著。圖3表明廢糖蜜和葵花油的交互作用對方程有影響但不顯著。因為廢糖蜜與葵花油之間雖不存在直接相關(guān)性，但由于廢糖蜜成分復(fù)雜，并含有部分不可溶物質(zhì)，而這些不可溶物質(zhì)中可能有少量是親油性物質(zhì)，溶解后可被微生物利用，或是部分有毒物質(zhì)溶解于油相后減輕了這些物質(zhì)對生物的毒害作用[16]。

為了確證各因素的最佳點，對已回歸的非線性模型方程(2)求一階偏導(dǎo)，并令其等于零，求解得：X=211.63、W=58.49、Z=6.01，在此培養(yǎng)條件下，AD產(chǎn)量達(dá)到2.55g/L。

3 結(jié) 論

通過均勻試驗對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。使用逐步回歸方法(stepwise)進(jìn)行回歸分析，得到最優(yōu)化培養(yǎng)基成分及含量：硝酸氨3.2g/L、磷酸二氫氨0.8g/L、氯化汞0.055g/L。在均勻試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，以葵花油、廢糖蜜、甾醇3個因素為自變量，通過三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計，建立了葵花油、廢糖蜜、甾醇三因素五水平的響應(yīng)面回歸模型。比較分析了3個因素對轉(zhuǎn)化影響大小，依次為廢糖蜜＞葵花油＞甾醇；甾醇和廢糖蜜交互作用對方程有影響但不顯著，葵花油與甾醇之間存在顯著的交互作用，廢糖蜜與葵花油存在交互作用。通過計算機(jī)模擬，結(jié)合實際生產(chǎn)情況得出最佳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件為廢糖蜜58.49mL/L、葵花油211.63mL/L、甾醇6.01g/L，在此條件下，AD產(chǎn)量達(dá)到2.55/L。且重復(fù)性實驗結(jié)果較好。

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Optimization of Androstenedione Bioconversion by Response Surface Methodology

YANG Ying1,2，JIANG Shao-tong2，LIU Mo2
(1. Department of Environment Engineering, Anhui University of Architecture, Hefei 230022, China；2. College of Biology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Bioconversion processing of androstenedione (AD) is strongly affected by many factors. Uniform design has been undertaken to evaluate the effects of substrate concentration, plant oil and molasses on bioconversion rate. Through regression analysis, the amounts of sunflower oil and molasses were important factors for bioconversion processing of AD. Response surface methodology (RSM) was used to optimize the critical factors. Through the analysis of quadratic regression model equation, the optimal processing parameters for bioconversion were 211.63 mL/L sunflower oil, 58.49 mL/L molasses and 6.01 g/L phytosterol. The optimal uniform design parameters were 3.2 g/L ammonium nitrate, 0.8 g/L ammonium dihydrogen phosphate, and 0.055 g/L mercury chloride. Under the optimal conditions, the production of AD was 2.55 g/L.

androstenedione；bioconversion；uniform design；response surface methodology；optimization

Q933

A

1002-6630(2010)24-0078-05

2010-05-09

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAD34B01)；國家“863”計劃項目(2007AA10Z361)；安徽省自然科學(xué)基金項目(070413265X)；安徽省科技廳2009年度科技攻關(guān)項目(08020203004)；安徽高校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2010A060)；安徽建筑工業(yè)學(xué)院博士基金支持項目

楊英(1963—)，女，副教授，博士，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：yangying5918@163.com