鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞c-Jun磷酸化的影響

鄒宇 李智勇 李強(qiáng) 李佳鳴,2 王剛,2 鄒德佳,2 周麗 牛英才

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所 黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江 佳木斯 154007; 3.齊齊哈爾市中醫(yī)院 黑龍江齊齊哈爾 16100)

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞c-Jun磷酸化的影響

鄒宇1李智勇3李強(qiáng)1李佳鳴1,2王剛1,2鄒德佳1,2周麗1牛英才1

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所 黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江 佳木斯 154007; 3.齊齊哈爾市中醫(yī)院 黑龍江齊齊哈爾 16100)

目的 探討鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液對(duì)甲基-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞c-Jun磷酸化的影響。方法 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液預(yù)處理體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞后,加入MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型。用Western blotting檢測(cè)c-Jun和phospho-c-jun蛋白表達(dá)。結(jié)果 MPP+處理72h,與空白對(duì)照組比較,模型組phospho-c-jun蛋白表達(dá)顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液組phospho-c-jun蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而各組之間c-jun蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞c-Jun磷酸化具有抑制作用。

帕金森病 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 載藥腦脊液 c-Jun 1-甲基-4-苯基吡啶離子

帕金森病是一種典型的中樞神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)疾病,多見(jiàn)于中老年人,臨床癥狀為:靜置性振顫,肌僵直,動(dòng)作遲緩等。帕金森有許多致病因素,發(fā)病機(jī)制尚未完全研究清楚,但基底神經(jīng)節(jié)黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元死亡是其共同特征[1]。有研究認(rèn)為,凋亡可能在PD發(fā)病過(guò)程中起重要作用,而JNK通路可能與PD發(fā)病密切相關(guān)。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯出自醫(yī)家張錫純之《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》,具有平肝鎮(zhèn)逆降沖的功效。研究表明其能促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá),拮抗腦細(xì)胞缺氧,保護(hù)腦組織[2]。本研究采用腦脊液藥理實(shí)驗(yàn)方法,觀察傳統(tǒng)經(jīng)方鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞c-Jun磷酸化的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

SD雄性大鼠,體重(190～210g),購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。PC12細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù),在DMEM高糖培養(yǎng)液(pH7.0)、37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液含3.7%的碳酸氫鈉、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清和1%谷氨酰胺。

1.2 藥品與試劑

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯由懷牛膝30g、代赭石30g、龍骨30g、牡蠣30g、龜板30g、玄參15g、天冬15g、白芍30g、茵陳15g、川楝子10g、麥芽30g、甘草6g組成。中藥水煎、過(guò)濾、濃縮后,令每毫升含生藥2g,儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(hyclone公司);MPP+(Sigma公司);蛋白提取試劑盒(碧云天公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司);p-c-jun兔抗鼠多克隆抗體、c-jun抗鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG二抗(Santa公司)。

2 方法

2.1 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯載藥腦脊液(CSF-ZGXF)制備

SD雄性大鼠按含生藥28g/kg給予鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯水煎劑,正常對(duì)照組給予同體積生理鹽水。最后1次給藥1.5h后,3%的水合氯醛麻醉SD大鼠,頸后部備皮并用75%酒精消毒。從大鼠枕骨大孔進(jìn)行無(wú)菌穿刺并緩慢抽出腦脊液。腦脊液3000rpm4℃離心10min,收集上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 藥物處理

實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、MPP+對(duì)照組、CSF-ZGXF組,共3組。PC12細(xì)胞經(jīng)0.125%胰蛋白酶消化后以1×105細(xì)胞/cm2接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h。各組細(xì)胞加入CSF或培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)30min后,正常對(duì)照組加入培養(yǎng)基,其他2組分別加入含250μmol/L MPP+的DMEM培養(yǎng)基,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72h。

2.3 Western blotting檢測(cè)PC12細(xì)胞p-c-jun蛋白表達(dá)

采用細(xì)胞蛋白抽提試劑盒提取PC12細(xì)胞蛋白質(zhì),提取的蛋白質(zhì)保存于-70℃低溫冰箱備用。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)提取樣品中蛋白質(zhì)的濃度后,將蛋白質(zhì)50μg加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。膠中蛋白質(zhì)在70mA恒流狀態(tài)下4℃過(guò)夜電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜經(jīng)5%脫脂奶粉在37℃封閉2h。加入一抗c-jun(1∶1500)和p-c-jun(1∶1000),硝酸纖維素膜4℃孵育過(guò)夜。與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶5000)37℃孵育1h。用western blotting印跡熒光發(fā)光檢測(cè)試劑盒曝光、壓片。western blotting檢測(cè)結(jié)果采用AlphaImager(tm)圖像分析系統(tǒng)掃描,利用AlphaEaseFC軟件中SpotDenso功能測(cè)定積分光密度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組之間差異的顯著性分析采用2組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

western blotting檢測(cè)PC12細(xì)胞p-c-Jun蛋白表達(dá)(圖1和表1)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,MPP+組p-c-Jun表達(dá)顯著上調(diào)。與MPP+組,CSF-ZGXF組的p-c-Jun蛋白的表達(dá)顯著降低。

4 討論

帕金森病病機(jī)復(fù)雜,在短期內(nèi)要獲得很好的療效,則有一定困難。西醫(yī)目前臨床治療PD,主要是應(yīng)用L-多巴等DA替代療法,雖能使PD患者的臨床癥狀在一定時(shí)間內(nèi)獲得一定程度的好轉(zhuǎn),但均不能阻止本病的自然進(jìn)展,且各種藥物都有不同程度的毒副反應(yīng),因而限制了其自身在臨床上的應(yīng)用[3]。因此研制安全、有效、可控的藥物是當(dāng)前乃至今后醫(yī)學(xué)科研的重點(diǎn)。挖掘中醫(yī)學(xué)寶庫(kù),篩選有效且毒副作用小的方藥越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注。

表1 含藥CSF對(duì)PC12細(xì)胞p-c-jun蛋白表達(dá)的影響()

表1 含藥CSF對(duì)PC12細(xì)胞p-c-jun蛋白表達(dá)的影響()

注:與MPP+處理組比較,*P<0.01

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采用中藥及復(fù)方直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),難以反映機(jī)體真實(shí)血藥濃度下的藥理作用及變化規(guī)律,阻礙了中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究的發(fā)展。血清藥理學(xué)在方法學(xué)上解決了中藥復(fù)方提取物直接應(yīng)用于離體實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn),可以研究進(jìn)入體內(nèi)的中藥有效成分或其代謝產(chǎn)物的藥理作用。在體外進(jìn)行中藥對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用研究時(shí),由于血腦屏障的存在,使腦的內(nèi)環(huán)境、神經(jīng)元生存的微環(huán)境與身體血液系統(tǒng)有著顯著的不同,而且藥物是否能透過(guò)血腦屏障成為研究中藥神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵。同時(shí),由于血清中含有多種活性酶及蛋白,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞均有一定的影響?；诖?梅建勛等用含藥腦脊液代替含藥血清,建立了中藥腦脊液藥理學(xué)方法。本研究采用腦脊液藥理學(xué)方法克服了中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在血腦屏障的問(wèn)題,同時(shí)排除了體外實(shí)驗(yàn)的各種干擾因素,可直接以觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥效學(xué)效應(yīng)。

絲裂原激活的蛋白激酶是信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞。從細(xì)胞外刺激作用于細(xì)胞,至細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng),其間通過(guò)了MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多級(jí)蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。JNK信號(hào)通路是MAPK中重要的通路之一。JNK的活化是通過(guò)其氨基酸殘基磷酸化,一旦被激活,胞漿中的JNK移位到細(xì)胞核?；罨腏NK可以和c-Jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合,使轉(zhuǎn)錄因子的活性區(qū)域發(fā)生磷酸化。c-Jun屬于亮氨酸拉鏈家族成員,它以同二聚體或異二聚體復(fù)合物的形式和許多基因啟動(dòng)子上的AP-1(activator protein-1)和AP-1樣位點(diǎn)結(jié)合,提高AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。研究提出將JNK下游底物c-Jun的顯性阻滯突變體轉(zhuǎn)染至NGF誘導(dǎo)分化的PC-12細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)該突變體可以抑制MEKK1及NGF撤除誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。最近一些研究也證實(shí)JNK通路的激活與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。c-Jun的過(guò)度激活與表達(dá)能提高轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1的DNA結(jié)合活性,促進(jìn)多種凋亡蛋白的表達(dá),從而啟動(dòng)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,CSF-ZGXF組p-c-jun蛋白表達(dá)顯著升高;與MPP+組比較,CSF-ZGXF組p-c-jun蛋白表達(dá)顯著降低,表明CSF-ZGXF對(duì)MPP+誘導(dǎo)的c-jun磷酸化具有一定抑制作用。因此,我們推測(cè),鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可能通過(guò)抑制c-jun磷酸化,從而起到對(duì)PC12細(xì)胞的損傷保護(hù)作用,進(jìn)而發(fā)揮抗PD作用。

[1]Naoi M,Maruyama W.Cell death of dopamine neurons in aging and Parkinson's disease[J].Mech Ageing Dev,1999,111(2～3):175～188.

[2]夏榮蓉,吳顥昕,姜惟.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α的影響[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2005,7(18):958～959.

[3]高敏,郭彩紅,林瑩瑩.帕金森病的中醫(yī)臨床研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,12(2):11～13.

[4]Bochu W,Liancai Z,Qi C.Primary study on the application of Serum Pharmacology in Chinese traditional medicine[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2005,43(3～4):194～197.

Effect of Cerebrospinal Fluid Containing Zhenganxifeng Decoction on C-Jun Phosphorylation in PC12 Cell Induced by MPP+

ZOU yu LI Zhiyong LI Qiang et al
1.TIsfsihar Medicou school medicopHarmaceutical science Research institute,Heilongjiang 161006;
2.Kiamusu Umiversity Chemistry and couege of pharmacy Heilongjiang province biolgy medicine preparation Key laboratory,Heilongjiang 154007;
3.TsitsiHar Chinese medicine hosptial,Heilongjiang 161000,China

Objective To investigate the effect of cerebrospinal fluid containing Zhenganxifeng decoction (CSF-ZGXF) on c-Jun phosphorylation in PC12 cell induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+).Methods CSF-ZGXF were administrated 30 min before addition of MPP+into PC12 cell cutrure.Protein expression of c-Jun and phospho-c-jun was detected by western blotting.Results The protein expression of phospho-c-jun was up-regulate in MPP+groups compared with the control group. That were downregulated in CSF-ZGXF group compared with the MPP+group.Conclusion The results suggest that CSF-ZGXF suppress c-Jun phosphorylation in PC12 cell induced by MPP+.

Parkinson's disease;Zhenganxifeng decoction;Cerebrospinal Fluid containing;C-jun;1-methyl-4-phenylpyridinium

R285.5

A

1674-0742(2010)08(c)-0006-02

2010-04-23