基于超濾法從牛初乳中分離胰島素樣生長因子-Ⅰ的工藝條件

郭 洪，陳慶森*，閆亞麗

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

基于超濾法從牛初乳中分離胰島素樣生長因子-Ⅰ的工藝條件

郭 洪，陳慶森*，閆亞麗

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

利用超濾技術(shù)從牛初乳中分離IGF-Ⅰ，并對脫脂和超濾條件進(jìn)行優(yōu)化。IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度檢測采用放射免疫法測定，總蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定。結(jié)果表明：牛初乳中分離IGF-Ⅰ過程中制備脫脂乳最適工藝條件為36℃、4000r/min離心15min；經(jīng)截留分子質(zhì)量為10～20kD的中空纖維膜超濾除雜蛋白和6kD的中空纖維膜超濾去除乳糖等小分子物質(zhì)，所得的IGF-Ⅰ的純度濃度較初乳中提高了約3660倍。本方法確立了從牛初乳中分離純化較高純度IGF-Ⅰ的技術(shù)路線。

牛初乳；胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)；脫脂；超濾法；工藝條件

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-Ⅰ，簡稱IGF-Ⅰ)與胰島素有相似的結(jié)構(gòu)，且與胰島素享有70%的同源性，是一類具有細(xì)胞分化和增殖功能，并具有胰島素樣作用的多肽[1-2]，因此，被命名為胰島素樣生長因子。其分子質(zhì)量為7649D，等電點(diǎn)是8.4[3]。IGF-Ⅰ在細(xì)胞分化、動(dòng)物生長發(fā)育、繁殖、代謝等方面發(fā)揮著廣泛的作用，特別是通過刺激腸道上皮的生長繁殖，維護(hù)由腸道黏膜上皮層及附著于表面的黏液層構(gòu)成的腸道機(jī)械屏障功能，從而對胃腸道黏膜自身穩(wěn)態(tài)和傷口愈合起重要作用[4]。它除了在組織細(xì)胞存在外，在牛的初乳中大量存在[5-9]。牛初乳來源廣泛，從牛初乳中提取IGF-Ⅰ可實(shí)現(xiàn)資源利用和提高附加值的目的。牛初乳是指奶牛分娩后7d內(nèi)特別是3d內(nèi)所分泌的乳汁。國內(nèi)外許多研究表明因采集牛初乳的時(shí)間等條件存在著較大差異，報(bào)道的IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度多在50～200μg/L之間，而常乳IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度不足10μg/L[10-12]。

目前國內(nèi)外分離牛初乳中IGF-Ⅰ的主要方法是凝膠過濾層析法和離子交換層析法，存在耗時(shí)長、成本較為昂貴的缺點(diǎn)。進(jìn)入20世紀(jì)90年代，超濾技術(shù)被引入到IGF-Ⅰ的研究中，該法節(jié)省人力、物力和時(shí)間[13-14]。

本研究主要對初乳脫脂以及利用中空纖維膜超濾技術(shù)純化IGF-Ⅰ的條件進(jìn)行研究，擬建立并確立中試規(guī)模生產(chǎn)IGF-Ⅰ的技術(shù)路線及相關(guān)參數(shù)，為牛初乳的進(jìn)一步開發(fā)利用提供有益探索。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛初乳 天津海河乳業(yè)有限公司奶源基地；木瓜凝乳酶 廣西南寧龐博生物有限公司；IGF-Ⅰ放射免疫試劑盒 天津九鼎生物有限公司；考馬斯亮蘭試劑 Sigma公司。

中空纖維膜組件(截留分子質(zhì)量60～80kD，截留分子質(zhì)量10～20kD，截留分子質(zhì)量6kD 天津膜天膜生物技術(shù)有限公司)；FD-1型冷凍干燥機(jī) 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；79.3型磁力恒溫?cái)嚢杵?常州國華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 初乳脫脂工藝方法[6]

將初乳經(jīng)多層紗布真空抽濾，除掉肉眼可見的雜質(zhì)，制得預(yù)處理的初乳。制備脫脂初乳分別考察離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間、溫度等不同參數(shù)，并進(jìn)行條件優(yōu)化，通過測定初乳及脫脂乳中的脂肪含量，計(jì)算脫脂率。同時(shí)測定每步中IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及總蛋白濃度，篩選出最適制備脫脂初乳的工藝條件。

1.2.2 制備IGF-Ⅰ粗提物的參數(shù)條件[15]

1.2.2.1 乳清制備

新鮮配制10%(m/V)的木瓜凝乳酶溶液，預(yù)熱至36℃，按酶液:脫脂初乳為1:50(V/V)的量緩緩加入脫脂初乳液(36℃，HCl溶液調(diào)pH6.0)中，充分混合均勻，靜置40min使之凝結(jié)。攪拌使凝乳破碎釋放乳清，離心(3000r/min，15min)去凝結(jié)蛋白，得初乳乳清。

1.2.2.2 去除IGF-Ⅰ結(jié)合蛋白

將制得的初乳乳清低溫冷卻后與同樣低溫冷卻的酸醇溶液(2mol/L HCl溶液:無水乙醇為1:7)混合，略加攪拌，4℃條件下靜置30min，去除IGF-Ⅰ結(jié)合蛋白。其中初乳乳清:酸醇溶液為1:4(V/V)。

1.2.2.3 減壓濃縮

在44℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液的1/3～1/4，將濃縮液調(diào)pH6.5，以除掉乙醇和HCl。離心(3000r/min，15min)取得上清液，作為超濾的前處理物。

1.2.2.460 ～80kD中空纖維超濾膜超濾

使用60～80kD超濾膜的參數(shù)條件設(shè)定為24℃、pH6.5、操作壓力0.06MPa，目的是除掉大分子質(zhì)量雜蛋白。

經(jīng)過以上步驟后可制得IGF-Ⅰ粗提物。

1.2.3 初乳IGF-Ⅰ精制備的參數(shù)條件確定[15]

對IGF-Ⅰ的兩步純化均使用中空纖維超濾膜，截留分子質(zhì)量分別為10～20kD和6kD的超濾膜，兩步操作均設(shè)計(jì)了壓力、溫度、pH值的3個(gè)參數(shù)條件的優(yōu)化。

1.2.3.1 10～20kD膜超濾

參數(shù)分別為溫度(4、20、36℃)、壓力(0.04、0.06、0.08MPa)、pH值(4.5、5.5、6.5)，為使提取損失減少，采用1000mL粗提液與2200mL純水混合，取得3000mL濾出液的比例進(jìn)行。

1.2.3.2 6kD膜超濾

參數(shù)分別為溫度(4、20、36℃)、壓力(0.04、0.06、0.08MPa)、pH值(6.0、7.0、8.0)，為盡可能除去乳糖和礦物質(zhì)等雜質(zhì)，采用1000mL一步純化產(chǎn)物和2200mL純水混合，取得400mL濃縮液的比例進(jìn)行。

1.2.4 IGF-Ⅰ質(zhì)量濃度及總蛋白濃度測定[15]

IGF-Ⅰ質(zhì)量濃度測定：采用放射免疫法，利用放射免疫試劑盒通過γ-計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測[7]；各步中的總蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮蘭法測定。在條件優(yōu)化過程中，溶液體積以及蛋白含量均發(fā)生變化，故引入“相對濃度”來考察，即：

1.2.5 脂肪含量測定

參照GB/T 5409—85《牛乳檢驗(yàn)方法》的方法即哥特里-羅茲法進(jìn)行[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛初乳脫脂工藝的確定

只能這樣了，何良諸繞到車那面，蹲在踏板上，小勺沒有發(fā)現(xiàn)。就是看見了，車門外掛大肉，也不是司機(jī)買的?？ㄜ嚻饎?dòng)，加速，寒風(fēng)呼嘯，出街口后，道路孬，車沒命地顛簸，何良諸摳車門的手，凍得粘住了，挺起脖子，看見趙集直勾勾前視，嘴角掛著暖和的笑。何良諸憤怒了，這家伙，怎么會(huì)笑！車沒有停下的意思，叫車豁子涮了！何良諸又急又恨，心里明白，卻不敢亂動(dòng)，舉了幾次，終于把凍僵的手像棍子似豎起來，梆梆梆敲玻璃。趙集嚇了一跳，才想起門外掛塊肉，急煞車。趙集扭身推車門，何良諸蹲在踏板上。趙集貼住車窗，叫嚷：“下去?！?/p>

從牛初乳中提取IGF-Ⅰ，首先是通過離心方法脫脂，因脂肪的存在直接影響IGF-Ⅰ的含量及穩(wěn)定性。此外，脫脂還可以防止脂肪氧化產(chǎn)生不良風(fēng)味，提高初乳流動(dòng)性。在離心脫脂過程中，會(huì)有總蛋白及IGF-Ⅰ的損失，所以在離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間及溫度等操作參數(shù)影響初乳中脂肪的脫除，本研究將初乳乳脂的脫除率和IGF-Ⅰ的損失率綜合考慮，以保證乳脂肪盡量脫除的前提下，最大限度保留IGF-Ⅰ。因此考察離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間及溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及含脂率的影響。

2.1.1 離心轉(zhuǎn)速對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及脫脂率的影響

表1 離心轉(zhuǎn)速對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及脫脂率的影響Table1 Effect of centrifugation speed on the content of IGF-I, total protein and degreasing rate

由表1看出，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，IGF-Ⅰ和總蛋白的質(zhì)量濃度均略有減少，脫脂率顯著增高，而IGF-Ⅰ的相對濃度有所增加，為達(dá)到脫脂率較高，而IGF-Ⅰ損失相對較小的目標(biāo)，故選定4000r/min為最適離心轉(zhuǎn)速。

2.1.2 離心時(shí)間對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及脫脂率的影響

表2 離心時(shí)間對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及脫脂率的影響Table2 Effect of centrifugation time on the content of IGF-Ⅰ, total protein and degreasing rate

由表2可見，隨著離心時(shí)間的增加，蛋白發(fā)生沉淀，IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度減少，IG-Ⅰ相對濃度增加。在保證脫脂率的前提下，而減少IGF-Ⅰ的損失，故采用離心15min 為最適離心時(shí)間。

2.1.3 離心溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及脫脂率的影響

表3 離心溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度及脫脂率的影響Table3 Effect of centrifugation temperature on the content of IGF-Ⅰand total protein and degreasing rate

從表3可以看出，隨著離心溫度的升高，初乳的黏度下降，流動(dòng)性增加，IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度和相對濃度均有所增加，含脂率大幅降低，因此選定36℃為最適離心溫度。

2.2 IGF-Ⅰ前處理過程中IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的變化

依據(jù)1.2.2節(jié)所確立的方法及參數(shù)條件，試驗(yàn)所得各項(xiàng)結(jié)果見表4。

表4 前處理操作對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table4 Effect of pretreatment methods on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表4可得，由于對牛初乳所進(jìn)行的前處理過程中酸醇去結(jié)合蛋白，旋蒸濃縮及超濾操作造成的溶液體積及料液濃度變化，IGF-Ⅰ及總蛋白質(zhì)量濃度有所波動(dòng)，但I(xiàn)GF-Ⅰ的相對濃度則急劇增加，比初乳中IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度增加796倍，說明這些前處理操作對獲取高品質(zhì)的IGF-Ⅰ是有效的，這將為后續(xù)的IGF-Ⅰ純化提供了基礎(chǔ)。

2.3 超濾條件對制備高純度IGF-Ⅰ的影響

2.3.110 ～20kD超濾純化IGF-Ⅰ的研究結(jié)果

經(jīng)過1.2.2節(jié)的方法得到的IGF-Ⅰ粗提物已除掉了大部分的雜蛋白，使IGF-Ⅰ的相對濃度顯著提高。根據(jù)IGF-Ⅰ的分子質(zhì)量研究選擇10～20kD的超濾膜，進(jìn)一步除雜蛋白，對該超濾分離條件進(jìn)行了研究。結(jié)果見表5～7。

表5 超濾pH值對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table5 Effect of pH during ultra-filtration with 10－12 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

表6 超濾溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table6 Effect of temperature during ultra-filtration with 10－12 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

從表5可知，在超濾pH5.5時(shí)處于β-乳球蛋白(分子質(zhì)量在30kD左右)等電點(diǎn)范圍內(nèi)使其凝聚力增加，增

強(qiáng)了超濾膜對其的截流作用，此時(shí)IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及相對濃度均較高，因此選擇超濾pH5.5作為超濾分離IGF-Ⅰ的最適pH值。

由表6可看出，在36℃時(shí)IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及相對濃度均較高，原因可能為在溫度較高的條件下，液體黏度降低，流動(dòng)性增加，有助于IGF-Ⅰ透過超濾膜，但是更高的溫度會(huì)使蛋白失活，造成IGF-Ⅰ的損失，不能作為可選的溫度參數(shù)來考察。因此選擇超濾溫度36℃作為超濾的最適溫度。

表7 超濾壓力對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table7 Effect of pressure during ultra-filtration with 10－12 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表7可見，隨壓力的增大，IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及總蛋白質(zhì)量濃度均升高，而相對質(zhì)量濃度在0.06MPa時(shí)為最高，原因可能為壓力升高使大于截留分子質(zhì)量的雜蛋白IGF-Ⅰ透過中空纖維，使得IGF-Ⅰ相對濃度降低，因此選擇0.06MPa作為超濾的最適壓力。

2.3.26 kD超濾膜超濾去除乳糖等小分子物質(zhì)的相關(guān)條件

為了獲得更高純度的IGF-Ⅰ，研究用截留分子質(zhì)量為6kD超濾膜是為了除掉乳糖和礦物質(zhì)等小分子雜質(zhì)，并對終產(chǎn)物進(jìn)行濃縮。結(jié)果見表8～10。

表8 超濾pH值對 IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table8 Effect of pH during ultra-filtration with 6 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表8看出，在pH8.0時(shí)IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及相對濃度均較高，原因可能為IGF-Ⅰ的等電點(diǎn)在8.0左右，調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0時(shí)，IGF-Ⅰ的凝聚力增強(qiáng)，減少了對超濾膜的透過率，通過時(shí)增加了對其他雜蛋白的通透性。因此IGF-Ⅰ得到了進(jìn)一步的純化。

表9 超濾溫度對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table9 Effect of temperature during ultra-filtration with 6 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表9可見，在36℃時(shí)IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及相對濃度均較高，原因可能為升高溫度液體粘度降低，有助于乳糖等小分子黏性物質(zhì)的通過，從而提高溶液中IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及相對濃度。

表10 超濾壓力對IGF-Ⅰ和總蛋白質(zhì)量濃度的影響Table10 Effect of pressure during ultra-filtration with 6 kD membrane on the content of IGF-Ⅰand total protein

由表10看出，隨超濾壓力的增大，濃縮液中IGF-Ⅰ的質(zhì)量濃度及總蛋白質(zhì)量濃度均降低，原因可能為隨壓力增大，IGF-Ⅰ和大于截留分子質(zhì)量的雜蛋白均透過中空纖維膜。IGF-Ⅰ的相對濃度在0.06MPa時(shí)為最高，其相對濃度較初乳中提高約3660倍，因此選擇0.06MPa作為超濾的最適壓力。

3 結(jié) 論

本研究最終確定從牛初乳中分離IGF-Ⅰ的脫脂工藝最適條件為采用4000r/min、15min、36℃離心條件下制備脫脂乳；經(jīng)木瓜凝乳酶制備乳清后用酸醇溶液去除結(jié)合蛋白，然后采用10～20kD中空纖維超濾除雜蛋白，確定的最佳參數(shù)條件為溫度36℃、pH5.5、操作壓力0.06MPa；采用6kD中空纖維超濾去除乳糖等小分子物質(zhì)，確定的最佳參數(shù)條件為溫度36℃、pH8.0、操作壓力0.06MPa；經(jīng)過兩步超濾純化后，IGF-Ⅰ的相對濃度比初乳中增加3660倍。本研究獲得了高純度的IGF-Ⅰ產(chǎn)品，為采用規(guī)?；椒ㄉa(chǎn)IGF-Ⅰ產(chǎn)品提供一定的參考價(jià)值。

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Use of Ultra-filtration for Separation of Insulin-like Growth Factor-Ⅰfrom Bovine Colostrums

GUO Hong，CHEN Qing-sen*，YAN Ya-li
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Insulin-like growth factors play important roles in the cell differentiation, animal growth, development, reproduction and metabolism, and are largely present in the bovine colostrums. In present study, insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ) was separated from bovine colostrums by using ultra-filtration, and the degreasing and ultra-filtration conditions were optimized. The IGF-Ⅰand total protein concentrations were detected by radio-immunoassay(RIA) and coomassie blue staining, respectively. The results showed that the optimum degreasing conditions were as follows: centrifugation temperature 36 ℃, centrifugation speed 4000 r/min and centrifugation time 15 min. Macromolecular impurities protein and lactose could be removed after ultra-filtration with molecular weight cut-off 10－20 kD and 6 kD membrane, respectively. The relative concentration of IGF-Ⅰwas 3660 times higher than that in colostrums after ultra-filtration.

colostrums；insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ)；lipid extraction；ultra-filtration；technological conditions

TS252.1

A

1002-6630(2010)22-0086-05

2010-07-19

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(09ZCKFNC00700)

郭洪(1983—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、乳品質(zhì)量與安全。E-mail：gh20020700@sina.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、乳品質(zhì)量與安全。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn