冬季貯存甜瓜腐爛病原菌的分離與鑒定

阿不都外力·阿不都熱依木，孫 磊，古麗斯瑪依·艾拜都拉，艾爾肯·艾米爾，鄺海菊，孜來古麗·米吉提，艾爾肯·熱合曼，古麗斯瑪依·艾拜都拉,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

冬季貯存甜瓜腐爛病原菌的分離與鑒定

阿不都外力·阿不都熱依木1，孫 磊1，古麗斯瑪依·艾拜都拉1，艾爾肯·艾米爾2，鄺海菊1，孜來古麗·米吉提1，艾爾肯·熱合曼1，古麗斯瑪依·艾拜都拉1,*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)理化測試中心，新疆 烏魯木齊 830046)

從冬季貯存甜瓜的腐爛組織中分離病原菌，并對其類型進行檢測分析。利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)，依據(jù)微生物形態(tài)特性，真菌的26S rRNA序列和細(xì)菌的16S rRNA序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育進化分析等分子生物學(xué)方法，共分離到22株菌種，其中真菌13株：包括青霉2株、鏈格孢4株、白地霉4株、酵母3株(梅奇氏酵母2株、畢赤酵母1株)；細(xì)菌9株：包括沙雷氏菌5株，丁香菌1株，克雷伯菌、腸桿菌和芽孢桿菌各1株。根據(jù)26S rRNA D1/D2區(qū)序列比對和系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，兩株酵母菌121和122可能是梅奇氏酵母屬潛在的新種。青霉和鏈鉻孢是甜瓜腐爛致病菌，白地霉和沙雷氏菌是人體致病菌，表明目前甜瓜貯存方法需要進一步改進和完善。

冬季腐爛甜瓜；病原菌；分離；鑒定；16S rRNA；26S rRNA

甜瓜是新疆一種重要的經(jīng)濟作物，新疆早熟甜瓜從6月就開始采摘上市，晚熟甜瓜可以保存至次年的2月份。實際上，直至每年的5月初在新疆各地市場都可見到冬季貯存甜瓜的銷售食用。冬季貯存的甜瓜作為新疆一種特有的貫穿秋、冬、春季的瓜果，在水果中具有極長的食用期和極高的保鮮價值。冬儲甜瓜的腐爛率可高達30%以上，很大程度上降低了貯存甜瓜的食用品味、經(jīng)濟價值和衛(wèi)生安全性。

貯藏期間適宜的溫度是保持甜瓜優(yōu)良品質(zhì)、減少腐爛和延長貯藏期的重要條件。低溫貯運雖然可以延緩甜

瓜果實的生理衰老、抑制病菌侵染和減少腐爛損耗，但是甜瓜果實對低溫較為敏感，尤其是在低于零度的條件下甜瓜易受凍害，解凍后常失去食用與商品價值。果蔬采摘后的病害由兩種侵染引起：采收以后病原菌通過機械傷口侵染和生長期間的潛伏侵染[1]。

國內(nèi)外對甜瓜貯藏期間病害的研究有許多報道，主要病害為軟腐病、紅粉病、白霉病、黑斑病、青霉病等[2-5]。梁寧等[6]通過形態(tài)觀察，從貯藏期甜瓜的病變組織中分離出7個類型的病原真菌，毛曉英等[7]也用同樣的方法大致分離出4個類型的甜瓜貯藏期病原真菌。本實驗對保鮮庫中保藏的冬儲甜瓜腐爛組織中分離的真菌進行形態(tài)觀察、表型分析，使用26S rRNA序列比對進行初步的分類學(xué)鑒定；并且對免疫性下降的甜瓜腐爛組織的細(xì)菌類群也進行檢測。選擇冬季貯存甜瓜為研究對象，探索其腐爛組織微生物類型，不僅對食品安全性具有重要意義，也為進一步改善貯存條件，選育甜瓜優(yōu)良品系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬季伽師瓜(金皇后86-1)購自烏魯木齊水果批發(fā)市場冷庫。

DNA聚合酶和dNTP、10×PCR Buffer 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。參照文獻[8]進行配制。

1.3 方法

1.3.1 冬季腐爛甜瓜病原菌的分離純化

用無菌解剖刀切去致病組織表皮，取出染病組織，觀察染病的特征，然后把染病甜瓜組織切成0.5cm2的小片貼在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)物稀釋到10-1、10-3、10-5、10-7、10-9、10-10在6組LB和PDA固體培養(yǎng)基上用涂布棒均勻涂布，將接種后的培養(yǎng)物分別放入恒溫箱中倒置培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度為37～38℃，PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為30℃；過夜后觀察其生長情況，利用平板劃線技術(shù)分離純化菌株。

1.3.2 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察

真菌通過觀察菌落特征，制作菌絲壓片，顯微鏡觀察孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。對細(xì)菌菌落形態(tài)及通過簡單染色、革蘭氏染色對細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)進行觀察[9]。

1.3.3 菌種的分子生物學(xué)鑒定

真菌基因組DNA的提取參照文獻[10]進行。細(xì)菌基因組DNA通過CTAB法[11]提取。

真菌26S rRNA D1/D2區(qū)序列擴增與擴增條件參照文獻[12]擴增，正向引物序列為P8：5′-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向引物序列為P9：5′-GGTCCGT GTTTCAAGACGG-3′。細(xì)菌基因組16S rRNA擴增與擴增條件參照文獻[13]擴增，正向引物序列為P1：5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物序列為P2：5′-A CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。引物合成和PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。在NCBI網(wǎng)上BLAST比對測序結(jié)果，從GenBank中查找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種進行鑒定分離菌株。另外從GenBank中提取所有與目的基因序列相關(guān)的已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列。通過軟件MEGA 4.0處理已有的全部序列，采用MEGA 4.0軟件中的N-J構(gòu)樹法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離與鑒定

圖1 梅奇氏酵母菌121和122基于26S rRNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 26S rRNA D1/D2 regions of strain 121 and strain 122

通過PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，從兩種腐爛甜瓜組織中共分離到13株真菌。從形態(tài)特性和26S rRNA D1/D2序列同源性(表1)上比較，顯示菌株S11、S12、S13、XJU8與鏈格孢屬，菌株S14、S15與青霉屬，S16、S17、S18、S19與白地霉屬和菌株121、122、XJURML1與酵母屬等4個屬菌種之間的親緣關(guān)系很近。根據(jù)26S rRNA D1/D2序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹也支持此結(jié)果。因此分離的這些真菌初步鑒定為鏈鉻孢屬(S11、S12、S13、XJU8)，白地霉屬(S16、S17、S18、S19)，青霉屬(S14、S15)和酵母屬(121、122、XJURML1)的變種。分離的兩株酵母121和122分別與M. bicuspidata CBS 5575 (L10685)和M. fructicola(AF360542)的26S rRNA D1/D2區(qū)序列相似性為98.10%和97.60%。而且菌株121和122基于26S rRNA D1/D2區(qū)序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹上以83%的自展值在與M. bicuspidata CBS 5575 (L10685)和M. fructicola(AF360542)相鄰的小分支上聚類在一起(圖1)。此結(jié)果表明這兩株可能是梅奇氏酵母屬潛在的新種。

表1 真菌26S rRNA D1/D2區(qū)序列同源性比較Table 1 Sequence similarity of 26S rRNA D1/D2 region in fungi

2.2 細(xì)菌的分離與鑒定

通過LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，從兩種腐爛甜瓜組織，共分離到9株細(xì)菌；這些菌株中革蘭氏陰性細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，分離的9株菌中8株為革蘭氏陰性細(xì)菌。16S rDNA序列同源性顯示，菌株S1、S3、S4、S7、S11與沙雷氏菌屬，菌株S13與腸桿菌屬，菌株S2與克雷伯菌屬，菌株S12與假單孢菌屬，菌株S5與芽孢桿菌屬等5個屬已報道的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA序列同源性均高于98.96%以上(表2)?；?6S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹也支持以上結(jié)果。根據(jù)此結(jié)果，初步鑒定分離的細(xì)菌菌株極可能是以上5個屬已知菌種的變種。

表2 冬季貯存腐爛甜瓜中獲得的細(xì)菌菌落形態(tài)特性和16S rDNA同源性比對Table 2 Morphological characteristics of colonies and 16S RNA sequence similarity of strains isolated from decayed melon stored in winter

2.3 冬貯甜瓜腐爛組織微生物類型的分析

國內(nèi)外對甜瓜貯藏期間病害研究很多，其結(jié)果都顯示青霉和鏈鉻孢是甜瓜主要腐爛致病菌，鏈鉻孢在水果中產(chǎn)生的黑斑病較為常見[1,5-7]。其次白地霉能產(chǎn)生亞硝胺、亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)對人類健康有著極大的危害性[14]。從26S rRNA D1/D2區(qū)序列相似性比對結(jié)果來看白地霉的3株(S16、S18、S19)與Geotrichum sp.同源性只有98%(表2)，可能是新變種。兩株酵母121和122的26S rRNA

D1/D2區(qū)序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中最近緣酵母菌株的同源性均低于98.10%，而且在系統(tǒng)進化樹中的靴帶值高達83%，表明是潛在的新種[15]，所分離的細(xì)菌類群中沙雷氏菌屬是在自然界中作為人類的條件致病菌，該屬有的種可能與人類菌血癥有關(guān)[16]。本實驗分離的菌株中沙雷氏菌屬的菌株類型最多(5株)，表明有害細(xì)菌類群在腐爛甜瓜組織中的存在較豐富。

在冬季甜瓜貯藏上，目前常用低溫控制結(jié)合化學(xué)滅菌。但是在本研究中發(fā)現(xiàn)，低溫條件下，所分離的真菌和細(xì)菌仍然有較強的繁殖能力，表明了低溫對此次分離的病原菌抑制作用不顯著，基于食品安全性的考慮對此應(yīng)當(dāng)給與足夠的重視；冬儲處理過程中避免鏈鉻孢、青霉、白地霉和沙雷氏菌的污染最為關(guān)鍵；因此，冬儲甜瓜保鮮的方法需要進一步改進完善。

3 結(jié) 論

本實驗共分離22株菌種：真菌13株，隸屬于4個(青霉、鏈鉻孢、白地霉、梅奇氏酵)屬；細(xì)菌9株，隸屬于5個(沙雷氏菌、腸桿菌、克雷伯菌、假單孢菌、芽孢桿菌)屬。青霉和鏈鉻孢是甜瓜腐爛致病菌。其次白地霉和沙雷氏菌屬是人類致病菌。根據(jù)26S rRNA D1/D2區(qū)序列比對和系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明兩株酵母菌121和122是潛在的新種，有鑒定酵母新種的意義。

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Isolation and Identification of Decay-inducing Pathogens from Melon Stored in Winter

Abduwali ABDUREYIM1，SUN Lei1，Gulsumay ABAYDULLA1，Erkin AMIR2，KUANG Hai-ju1，Zilaygul MIJIT1，Erken RAHMAN1，Gulsumay ABAYDULLA1,﹡
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China；2. Center of Analysis and Measurement, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Isolation and identification of pathogens from the decayed tissues of melon stored in winter were carried out using LB (lysogeny broth) and PDA (potato dextrose agar) media. Based on morphological characteristics, D1/D2 region of 26S rRNA sequences for fungi, 16S rRNA gene sequences for bacteria and phylogenetic trees, a total of 22 strains were isolated. Thirteen of them belonged to the family of fungi, including 2 strains of the genus Penicillium, 4 strains of the genus Alternaria, 4 strains of the genus Geotrichum, and 3 yeast strains (2 strains of the genus Metschnikowia and 1 strain of the genus Pichia); the rest were all bacteria, including 5 strains of Serratia. sp, 1 strain of cloves. sp, 1 strain of Klebsiella. sp, 1 strain of Enterobacter. sp and 1 strain of Bacillus. sp. The results of 26S rRNA and phylogenetic tree analysis revealed that 2 isolates (strain 121 and strain 122) were yeast, which may be a new species belonging to the genus Metschnikowia. Alternaria and Penicillium were pathogenic fungi for melon, and Geotrichum and Serratia. sp were pathogens for human. Therefore, these investigations demonstrate that current conditions for winter storage of melon should be improved.

decayed melon；winter storage；pathogens；isolation；identification；16S rRNA；26S rRNA

Q946

A

1002-6630(2010)17-0250-04

2009-12-23

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆武漢大學(xué)合作項目(201091236)

阿不都外力·阿不都熱依木(1982—)，男，碩士研究生，研究方向為資源微生物學(xué)。E-mail：abduwaly@gmail.com

*通信作者：古麗斯瑪依·艾拜都拉(1963—)，女，副教授，碩士，研究方向為資源微生物學(xué)。

E-mail：gulsimay2005@yahoo.com.cn