耐熱蛋白酶對UHT乳蛋白的水解作用

王 輝，呂加平*，劉 鷺，靳 磊

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質量控制重點開放實驗室，北京 100193；2.國家知識產(chǎn)權局專利審查協(xié)作中心，北京 100190)

耐熱蛋白酶對UHT乳蛋白的水解作用

王 輝1,2，呂加平1,*，劉 鷺1，靳 磊1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質量控制重點開放實驗室，北京 100193；2.國家知識產(chǎn)權局專利審查協(xié)作中心，北京 100190)

采用SDS-PAGE、Urea-PAGE分析耐熱蛋白酶對UHT乳蛋白的水解作用。結果表明：熒光假單胞菌(PF)蛋白酶和纖溶酶(PL)作用底物不同，產(chǎn)物也不同；前者優(yōu)先水解κ-酪蛋白生成副κ-酪蛋白，而PL主要水解β-酪蛋白與α-酪蛋白生成γ-酪蛋白及胨、肽等。分別經(jīng)PL和細菌蛋白酶水解3h的UHT乳水解產(chǎn)物，在pH4.6和12g/100mL三氯乙酸(TCA)沉淀后經(jīng)反相高效液相色潽儀(RP-HPLC)分析濾液，兩者呈現(xiàn)不同的色譜圖。

耐熱蛋白酶；UHT乳；水解

牛乳中的耐熱蛋白酶來源于乳本身(即內(nèi)源性)和牛乳污染微生物(外源性)[1-2]。內(nèi)源性酶主要是纖溶酶(plasmin，PL，EC3.4.21.7)，一般是由血液轉運至乳腺并分泌進入乳中；外源性酶主要是嗜冷菌胞外蛋白酶，原料乳中的嗜冷菌大多數(shù)來自榨乳過程各環(huán)節(jié)造成的污染[3-4]。這些酶耐熱性較強，即使是UHT乳，其纖溶酶的活性尚存30%～40%，殘留的酶活性將在產(chǎn)品貨架期內(nèi)緩慢作用于牛奶蛋白而導致產(chǎn)品出現(xiàn)黏度增加、蛋白凝結和乳清析出等質量問題[5-6]。因此，在我國UHT乳需求比例還在顯著增加的情況下，研究耐熱蛋白酶對UHT乳蛋白的水解方式及凝膠作用，為其質量問題的分析提供理論依據(jù)，進而更好地控制產(chǎn)品質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮無抗牛乳 中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧所奶站；UHT乳 市售。

考馬斯亮藍G-250、低分子質量標準蛋白、三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸(TFA) 美國Sigma公司；熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens，AS1.1802) 中國科學院微生物菌種保藏中心；纖溶酶(PL) Roche公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-16G-A冷凍離心機、LXJ-IIB低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠；WH-3微型旋渦振蕩器上海滬西分析儀器廠；DYY-6C型電泳儀、DYCY31A電泳槽 北京六一儀器廠；TS-1型脫色搖床 江蘇其林貝

爾儀器制造有限公司；Agilent 1100 series高效液相色譜、Tocan500全自動凝膠成像儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜冷菌蛋白酶對UHT乳蛋白的水解作用

嗜冷菌蛋白酶水解物的制備：將UHT乳無菌裝入250mL三角瓶(加入0.05g/100mL疊氮鈉以防止細菌增長)，加入產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)、經(jīng)硫酸銨分級沉淀、透析得到的粗酶液5mL，分別放6、12、24、36、48h后分別取樣。

SDS-PAGE電泳：參照Laemmli[7]的方法，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。凝膠染色以及脫色后，于凝膠成像儀進行成像處理。

1.3.2 纖溶酶(PL)對牛乳蛋白的水解作用

PL水解物的制備：原料乳經(jīng)4500r/min、4℃離心20min得脫脂乳，經(jīng)95℃、10min熱處理脫脂乳后用冰水及時冷卻至37℃，無菌取其100mL放入三角瓶中并加0.05g/100mL疊氮鈉防腐，然后加入酶活力為0.5U/mL的PL液1mL，于37℃持續(xù)水浴，分別于0、1、2、3d時取樣，利用超速離心方法獲得酪蛋白膠粒和懸浮液乳清兩部分，用于電泳分析。

SDS-PAGE電泳：超速離心酪蛋白部分用AndrewsUrea-PAGE方法[8]進行電泳，超速離心乳清相仍使用SDS-PAGE電泳，后者在樣品溶解液加體積分數(shù)10%β-巰基乙醇，不加PL的牛乳作為空白對照，凝膠染色以及脫色后，于凝膠成像儀成像處理。

1.3.3 RP-HPLC分析耐熱蛋白酶酶解樣品

為進一步分析PL和嗜冷菌蛋白酶對UHT乳蛋白不同水解方式和水解程度，采用RP-HPLC方法對耐熱酶的酶解樣品進行分析，觀察兩酶解樣品液相色譜圖的差異。

UHT乳酶解樣品的制備：在加入0.05g/100mL疊氮鈉的UHT乳中加入體積分數(shù)5%嗜冷菌蛋白酶粗酶液于40℃酶解24h；PL(10mg/L)37℃酶解24h，用于可溶性氮測定樣品的制備。

12g/100mL TCA、pH4.6可溶性氮的提?。簩?4g/100mL TCA加入到相同體積的兩種酶的蛋白水解乳樣中，體系中最終TCA為12g/100mL，振蕩混勻，室溫靜置1h，16000r/min離心30min，0.45μm微孔膜過濾得12g/100mL TCA可溶性氮提取物；用體積分數(shù)10%乙酸溶液調整兩種酶的蛋白水解乳樣pH值至4.6，振蕩混勻，室溫靜置1h，16000r/min離心30min，0.45μm微孔膜過濾得pH4.6的可溶性氮提取物，沒有添加蛋白酶的作為空白。

RP-HPLC條件：色譜柱：Venusil ASB-C18(4.6mm× 150mm，5μm)；柱溫：40℃；流速：1mL/min；波長：210nm；進樣量：20μL；流動相A為質量分數(shù)0.1% TFA水溶液；流動相B為質量分數(shù)0.1% TFA-乙腈溶液，流動相按體積分數(shù)進行線性梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫梯度表Table 1 Mobile phase gradient elution program

2 結果與分析

2.1 嗜冷菌蛋白酶對UHT乳蛋白的水解作用

圖1 嗜冷菌蛋白酶作用UHT乳蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of hydrolysates from UHT milk digested by proteases from psychrotrophic bacteria

由圖1可知，κ-酪蛋白明顯逐漸減少，para-κ-酪蛋白逐漸增加，說明嗜冷菌蛋白酶優(yōu)先水解乳中的κ-酪蛋白，生成副κ-酪蛋白。蛋白分離一般情況下是根據(jù)蛋白的相對分子質量來排序的，但單個蛋白的遷移時間卻未與相對分子質量一一對應，如κ-酪蛋白(相對分子質量19023)和β-乳球蛋白(相對分子質量18363)分子大小相似，遷移時間理應接近，然而，κ-酪蛋白的遷移時間卻與β-酪蛋白(相對分子質量23983)的相近，一方面可能是κ-酪蛋白是一種糖蛋白，它可優(yōu)先結合SDS，導致產(chǎn)生一種不規(guī)則的質荷比，改變了遷移率；另一方面，β-酪蛋白、αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白都含有磷酸基團，這也影響電荷密度。

2.2 PL對牛乳蛋白的水解作用

圖2 PL水解乳超離心酪蛋白部分Urea-PAGE電泳圖Fig.2 Urea-PAGE of casein protein from UHT milk digested by plasminogen after ultracentrifugation

由圖2可知，PL與熒光假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶對乳蛋白的水解方式存在很大差異，β-酪蛋白對PL是最敏感的，β-酪蛋白明顯減少，αs2-酪蛋白也有明顯的減少趨勢，αs1-酪蛋白被血纖維蛋白溶酶水解的程度并不明顯，而γ-酪蛋白卻有顯著的增加趨勢。雖然κ-酪蛋白包含幾個Lys和Arg殘基，但是它可以抵抗PL的水解作用，這可能與其含有較多二級和三級結構有關。

圖3 Plasmin水解乳超離心乳清部分SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of ultracentrifugal supernatant from UHT milk digested by plasminogen

由圖3可知，超離心懸浮部分中的κ-酪蛋白水平在37℃整個酶解過程中增加，這表明PL水解酪蛋白后，將κ-酪蛋白/β-乳球蛋白(β-lg)復合體釋放到乳清中。κ-酪蛋白/β-乳球蛋白(β-lg)復合體是在加熱的過程中形成的[9]。

2.3 酶解樣品可溶性肽的RP-HPLC色譜圖

圖4為UHT乳經(jīng)過PL和嗜冷菌蛋白酶水解3h后，酶解樣品的pH4.6可溶性肽的RP-HPLC色譜圖。從圖4可以看出，在PL水解牛乳樣品色譜圖中可以看出兩組不同的峰，第一組峰在大約20min之前，第二組峰，在20～35min之間，而來自嗜冷菌的蛋白酶水解乳樣品的色譜圖中吸收峰主要都集中在20min之前，只有第一組峰，沒有上述的第二組峰，第二組峰在由PL引起水解的樣品的色譜圖中。

圖4 酶解樣品的pH4.6可溶性肽的RP-HPLC色譜圖Fig.4 RP-HPLC profiles of soluble peptides (pH 4.6) in UHT milk and its hydrolysates prepared with different proteases

圖5 酶解樣品的12g/100mL TCA可溶性肽的RP-HPLC色譜圖Fig.5 RP-HPLC profiles of leftover supernatants after 12 g/100mL trichloroacetic acid precipitation of the 3 h hydrolysates of UHT milk prepared with different proteases

圖5 為UHT乳經(jīng)過PL和嗜冷菌蛋白酶水解3h后，酶解樣品的12g/100mL TCA可溶性肽的RP-HPLC色譜圖。在12g/100mL TCA可溶性提取物中，PL水解樣品在25min之前有很微弱吸收峰，30～35min范圍內(nèi)有微弱的吸收峰；由嗜冷菌蛋白酶水解的樣品在洗脫的大約前25min顯示了相當高的峰。相比之下，由PL水解樣品在色譜圖中除了在30～35min范圍內(nèi)有微弱的吸收峰外，幾乎沒有洗脫峰。原因主要是由于兩種蛋白酶的水解產(chǎn)物存在一定差異。嗜冷菌蛋白酶在相同的時間內(nèi)易于將

蛋白質水解為小肽和游離氨基酸，這些小肽和氨基酸能更好地溶解在12g/100mL TCA中。由PL水解β-酪蛋白形成的γ-酪蛋白和一些大肽片斷，大部分溶解在pH4.6溶液中，但容易被12g/100mL TCA沉淀下來，這些大片斷可能為一些“proteose peptone”。

3 討 論

研究表明，嗜冷菌蛋白酶水解κ-酪蛋白，生成副κ-酪蛋白。PL在適宜條件下，對α-酪蛋白、β-酪蛋白具有較強的水解作用，生成γ-酪蛋白及胨、肽等小片斷，但對κ-酪蛋白與乳清蛋作用很小，幾乎不對他們進行作用，這與國外報道[10-13]的結果類似。

兩種酶的水解產(chǎn)物在pH4.6和12g/100mL TCA濾液中呈現(xiàn)不同的RP-HPLC圖譜。由細菌蛋白酶水解蛋白質產(chǎn)生的肽沒有多少疏水性，在RP-HPLC中早些洗脫出來，PL水解物是更疏水的，在后面洗脫出來。這個結果除了吸收峰洗脫時間的分界點有些出入外，與Datta等[14]報導的相似，由細菌蛋白酶水解的樣品在洗脫的大約20min之前顯示了相當高的峰。Lopez-Díaz等[15]也報道了較相似的結果，同時他們比較了PL和P. fluorescens酶解樣品pH4.6和4g/100mL TCA濾液的色譜圖，色譜圖顯示在pH4.6提取物色譜圖中，細菌蛋白酶水解產(chǎn)生的大多數(shù)肽的洗脫峰在26min前出現(xiàn)。對于洗脫時間分界點的差異，這可能和細菌種類不同和實驗的系統(tǒng)誤差有關。Datta等[14]用熒光法對濾液中可溶性肽含量進行了測定，結果表明，細菌蛋白酶水解物在pH4.6和12g/100mL TCA的濾液和PL水解物pH4.6的濾液都顯示了較高的相對熒光強度，而PL水解物12g/100mL TCA的濾液幾乎沒有熒光產(chǎn)物的生成，這對色譜的結果進行了進一步證實。

4 結 論

4.1 熒光假單胞菌蛋白酶優(yōu)先水解乳中的κ-酪蛋白，生成副κ-酪蛋白。PL對α-酪蛋白、β-酪蛋白具有較強的水解作用，更易攻擊β-酪蛋白，生成γ-酪蛋白及胨、肽等小片斷，PL水解酪蛋白過程中將κ-酪蛋白/ β-乳球蛋白復合體釋放到乳清中。

4.2 兩種酶的水解產(chǎn)物在pH4.6和12g/100mL TCA濾液中呈現(xiàn)不同的RP-HPLC圖譜。由細菌蛋白酶水解蛋白質產(chǎn)生的肽沒有多少疏水性，在RP-HPLC中先洗脫出來，PL水解物較疏水，因此在后面洗脫出來。

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Hydrolysis Effect of Heat-resistant Protease on UHT Milk

WANG Hui1,2，L. U . Jia-ping1,*，LIU Lu1，JIN Lei1
(1. Institute of Agro-food Science and Technology, Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China；2. Patent Examination Cooperation Center of State Intellectual Property Office, Beijing 100190, China)

The effect of heat-resistant protease on protein proteolysis of UHT milk was evaluated by SDS-PAGE and Urea-PAGE. Results indicated that different proteases reacted with different substrates in milk to produce different peptides. Pseudomonas fluorescens protease hydrolyzedκ-casein into para-κ-casein. Plasminogen hydrolyzed α-casein and β-casein intoγ-casein, peptone and peptides. In addition, the leftover supernatants after trichloroacetic acid precipitation of the 3 h hydrolysates of UHT milk prepared with plasminogen and bacterial proteases exhibited different RP-HPLC profiles and those of the pH 4.6 soluble peptide in the 3 h hyolroluysates were also different.

heat-resistant protease；UHT milk；proteolysis

TS252.41

A

1002-6630(2010)17-0228-04

2009-12-15

國家科研院所社會公益項目(2002005DIA4G035-7)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A07；2006BAD04A10)

王輝(1974—)，女，講師，博士，研究方向為乳品科學與技術。E-mail：liquider@sina.com

*通信作者：呂加平(1963—)，男，研究員，博士，研究方向為乳制品加工。E-mail：lvjp586@vip.sina.com