富硒金針菇對羥自由基的清除作用

李華為，趙素云，鐵 梅,*

(1.沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036 )

富硒金針菇對羥自由基的清除作用

李華為1，趙素云2，鐵 梅2,*

(1.沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036 )

采用現(xiàn)代分離技術(shù)從富硒金針菇中提取硒多糖和硒蛋白，采用苯酚-硫酸法、ICP-MS法和考馬斯亮藍(lán)染色法對硒多糖中多糖含量、硒含量及硒蛋白中蛋白和硒的含量進(jìn)行測定；在Fenton體系的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，研究硒多糖和硒蛋白對羥自由基的清除作用。結(jié)果表明：硒多糖和硒蛋白清除羥自由基的效果比與之相同濃度的無機(jī)硒和相同濃度的多糖及蛋白都要明顯；其中，硒多糖的最高清除率可達(dá)65.05%，而硒蛋白的最高清除率可達(dá)19.67%。

金針菇；硒多糖；硒蛋白；羥自由基

硒是人體必需的微量元素，具有多種重要的生物學(xué)功能，對人類健康有著重要意義。不同形態(tài)的硒對機(jī)體的生物活性及安全性不同[1]。有機(jī)硒比無機(jī)硒具有吸收率高、生物活性強(qiáng)、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，因此硒的有機(jī)化研究是目前硒研究的一個(gè)熱點(diǎn)[2-3]。由于人們目前尚不能化學(xué)合成生物有機(jī)硒，因此只能通過生物富集進(jìn)行硒的有機(jī)化[4]。然而，由于生物體固有的復(fù)雜性，人們對動(dòng)植物及微生物體中硒的存在形態(tài)以及各形態(tài)中硒的含量尚未完全明了，其中部分形態(tài)的生物活性和化學(xué)穩(wěn)定性還有待于進(jìn)一步研究[5]，致使食品硒源在提供豐富硒的同時(shí)，對其安全評價(jià)缺乏應(yīng)有的理論依據(jù)。

自由基是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，羥自由基(·OH)是目前所知活性氧中對生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種[6]。研究表明，自由基與衰老、腫瘤、心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)功能減退等疾病相關(guān)[7]。因此，人們越來越認(rèn)識到清除體內(nèi)過剩自由基的重要性，羥自由基清除率也被作為一種物質(zhì)抗氧化作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。

含硒生物大分子如硒多糖、硒蛋白是生物體將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的有效形式之一[8]。本實(shí)驗(yàn)以富硒金針菇為載體，采用現(xiàn)代生物分離提取技術(shù)獲得天然有機(jī)含硒生物大分子，并考察其對羥自由基的清除作用，比較研究其與無機(jī)硒的生物活性，為開發(fā)天然有機(jī)硒補(bǔ)劑食品、研究其藥理作用及生物安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

富硒金針菇(源于同實(shí)驗(yàn)組同學(xué)自行培養(yǎng))。

硫酸亞鐵、過氧化氫、亞硒酸鈉、鄰二氮菲、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

7500c型電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS 美國Agilent公司；紫外-可見分光光度計(jì) 美國Varian公司；CLJ2000型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.2 含硒生物大分子的提取及其組分含量的測定

在最佳浸提條件下提取硒多糖和硒蛋白[8-9]。采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)染色法測得多糖和蛋白的含量[10]。用ICP-MS法測定硒多糖和硒蛋白中硒的含量[11]。

1.3 含硒生物大分子對羥自由基的清除作用

利用Fenton體系[12]測定含硒生物大分子對·OH的清除作用。Fe2+和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH，由于·OH可特異地使鐵-鄰二氮菲褪色，根據(jù)褪色程度用比色法于510nm波長處測定·OH含量。在Fenton體系中分別加入一定濃度不同體積的有機(jī)硒試液，用去離子水定容至10.0mL。于37℃恒溫水浴中反應(yīng)90min，以5mm比色皿測吸光度A510nm。受試樣表觀羥自由基清除率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖、蛋白及硒含量的確定

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for the determination of polysaccharides

圖2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for the determination of proteins

苯酚-硫酸法測定多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得金針菇硒多糖中多糖的質(zhì)量濃度為529.649μg/mL，金針菇硒蛋白中蛋白的質(zhì)量濃度為95.83μg/mL。通過ICP-MS法測得金針菇硒多糖中硒的含量為 0.01956μg/mL，金針菇硒蛋白中硒的含量為483.81μg/g。

2.2 Fenton體系實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.2.1 FeSO4、鄰二氮菲及H2O2體積分?jǐn)?shù)對ΔA510nm的影響

圖3 FeSO4濃度對ΔA510nm的影響Fig.3 Effect of FeSO4concentration on ΔA510nm

由圖3可知，隨著FeSO4濃度的增加(固定H2O2體積分?jǐn)?shù)及鄰二氮菲濃度)，ΔA510nm也隨之變大，當(dāng)Fe2+濃度增至0.6mmol/L時(shí)，ΔA510nm達(dá)到最大。進(jìn)一步增加Fe2+濃度，ΔA510nm反而下降，故本實(shí)驗(yàn)選取Fe2+濃度為0.6mmol/L。

圖4 鄰二氮菲濃度對ΔA510nmμ的影響Fig.4 Effect of 1,10-phenanthroline concentration onΔA510nmμ

圖5 過氧化氫體積分?jǐn)?shù)對ΔA510nm的影響Fig.5 Effect of H2O2concentration onΔA510nm

H2O2和鄰二氮菲對ΔA510nm的影響均呈正相關(guān)，如圖4、5所示。 因此選擇鄰二氮菲濃度和H2O2體積分?jǐn)?shù)分別為1mmol/L和0.01%。

2.2.2 保溫時(shí)間與ΔA510nm的關(guān)系

由于Fenton反應(yīng)具有明顯的動(dòng)力學(xué)特征，因而在指定的反應(yīng)溫度下(37℃)，反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時(shí)所需要的時(shí)間影響ΔA510nm。37℃水浴保溫120min時(shí)間內(nèi)，隨著保溫時(shí)間的延長ΔA510nm逐漸增大，90min后改變不明顯，所以設(shè)定加熱時(shí)間為90min(圖6)。

圖6 保溫時(shí)間對ΔA510nm的影響Fig.6 Effect of temperature holding time onΔA510nm

2.3 含硒生物大分子對羥自由基的清除作用

根據(jù)2.2節(jié)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照1.3節(jié)所述方法產(chǎn)生·OH的Fenton體系，分別加入已知硒含量和蛋白含量的硒蛋白、與硒蛋白中硒含量相同的亞硒酸鈉、與硒蛋白中蛋白含量相同的蛋白質(zhì)，使得蛋白質(zhì)的含量或硒的含量在同一水平；依次加入量為1、3、5mL(相應(yīng)硒含量分別為48.38、145.14、241.91μg/g)，測定體系中硒濃度由低到高的變化過程中ΔA510nm，以同樣的方法對硒多糖也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。

圖7 含硒生物大分子對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Se-binding biopolymers and their native counterparts on hydroxyl free radicals

由圖7可知：無論是A-T組還是B-T組，隨硒濃度的增加，A510nm都在增加；但硒蛋白(硒多糖)的增加比單純無機(jī)硒和普通金針菇蛋白(普通金針菇多糖)的增加對A510nm的影響大。對于同一加入量，兩組中無機(jī)硒和蛋白(多糖)溶液的A510nm無顯著差異，但硒蛋白(硒多糖)的A510nm卻存在顯著差異。對于從富硒金針菇中提取的兩種含硒生物大分子，隨著硒濃度的增加，硒多糖

A510nm增加的幅度明顯高于硒蛋白。

2.4 清除率的測定

圖8 硒多糖、普通多糖及亞硒酸鈉對·OH的清除率Fig.8 Scavenging effects of Se-binding polysaccharides, pure polysaccharides and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

圖9 硒蛋白、普通蛋白及亞硒酸鈉對·OH的清除率Fig.9 Scavenging effects of Se-binding protein, pure protein and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

無論是低質(zhì)量濃度組還是高質(zhì)量濃度組，富硒金針菇中的硒多糖或硒蛋白對·OH的清除率均顯著高于普通多糖(蛋白)以及亞硒酸鈉，如圖8、9所示，說明硒增強(qiáng)了多糖或蛋白消除·OH的活性，硒多糖或硒蛋白都比無機(jī)硒補(bǔ)劑具有更高的抗氧化作用；此外，在各質(zhì)量濃度組中，硒蛋白對·OH的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通蛋白和亞硒酸鈉對·OH的清除率之和，當(dāng)硒多糖的加入量為5mL時(shí)，硒多糖對·OH的清除率要大于普通多糖和亞硒酸鈉的加和，說明硒與食用菌蛋白或多糖之間在清除·OH方面存在著協(xié)同作用，此作用可使硒多糖的最高清除率達(dá)65.05%，硒蛋白的最高清除率達(dá)19.67%；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，對于亞硒酸鈉而言，當(dāng)它的質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加其清除效果會基本保持不變甚至有所降低，說明高質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉抑制了硒對·OH的清除作用，以亞硒酸鈉形式存在的硒在相同的硒水平下表現(xiàn)出硒的中毒現(xiàn)象。

2.5 硒多糖與硒蛋白對羥自由基清除作用比較

由圖8、9可知，同一加入量的硒多糖清除·OH的效果明顯的好于硒蛋白，將不同含硒量的硒多糖和硒蛋白對·OH的清除效果比較如圖10所示，結(jié)果表明，欲達(dá)到同樣的清除效果，所需硒多糖中硒的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硒蛋白中硒的含量，說明富硒金針菇中的硒多糖對·OH的清除效果、抗氧化性、生物活性要明顯好于硒蛋白。這也表明，在金針菇中與多糖結(jié)合的硒是主要存在形態(tài)，說明有機(jī)硒水平的高低直接影響著對·OH的清除效果。

圖10 硒多糖與硒蛋白對羥自由基清除作用的比較Fig.10 Comparison of hydroxyl free radical scavenging effects between Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins

3 結(jié) 論

通過生物富集培育的富硒金針菇含有大量的有機(jī)硒，其主要化學(xué)形態(tài)為硒多糖和硒蛋白，實(shí)驗(yàn)表明，有機(jī)硒多糖和硒蛋白相對無機(jī)硒具有更好的清除·OH、抗氧化活性作用，而且在富硒金針菇中硒多糖比硒蛋白的這種生物活性更強(qiáng)。這些含硒生物大分子化合物作為一種天然無毒高效的·OH清除劑，無論是對拮抗或抑制體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生，還是增強(qiáng)機(jī)體免疫活性方面，都是難得的有機(jī)硒源，以金針菇為富硒載體具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Scavenging Effect of Selenium-rich Flammulina velutipes on Hydroxyl Free Radicals

LI Hua-wei1，ZHAO Su-yun2，TIE Mei2,*
(1. College of Chemistry and Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China；2. School of Environmental Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China )

The fruit bodies of selenium-rich Flammulina velutipes were extracted by modern separation techniques to obtain Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins. Phenol-sulfuric acid method, ICP-MS and Coomassie brilliant blue G-250 dye method were used for the quantifications of polysaccharides, selenium and proteins, respectively. The scavenging effects of the Se-binding polysaccharide extract and the Se-binding protein extract on hydroxyl free radicals generated in a Fenton system were evaluated under optimal experimental conditions. It was found that the hydroxyl free radical scavenging effects of Sebinding polysaccharides and Se-binding proteins were more obvious than those of inorganic selenium, pure polysaccharides or pure proteins at the same concentrations. The maximum scavenging rates of Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins on hydroxyl free radicals were 65.05 % and 19.67%, respectively.

Flammulina velutipes；Se-binding polysaccharides；Se-binding proteins；hydroxyl free radicals

TS255.1

A

1002-6630(2010)17-0018-04

2010-01-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20611130317/B01)；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2008227)

李華為(1962—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：lhw62515@126.com

*通信作者：鐵梅(1964—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)食品生物化學(xué)。E-mail：tiemei07@yahoo.cn