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      甘草苷抗腦缺血再灌注炎性損傷研究

      2010-03-23 05:36:51孫雅煊戴雪伶高兆蘭鄭秋生
      食品科學(xué) 2010年23期
      關(guān)鍵詞:腦缺血甘草腦組織

      孫雅煊,劉 婷,戴雪伶,高兆蘭,魏 榮,鄭秋生

      (1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京 100191;2. 中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅 蘭州 730000;3. 石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆 石河子 832003)

      甘草苷抗腦缺血再灌注炎性損傷研究

      孫雅煊1,2,劉 婷3,戴雪伶1,高兆蘭1,魏 榮1,鄭秋生3

      (1.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京 100191;2. 中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅 蘭州 730000;3. 石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆 石河子 832003)

      目的:探討甘草苷抗小鼠腦缺血再灌注炎性損傷作用及機(jī)制。方法:將ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組(依達(dá)拉奉3mg/(kg bw·d)和甘草苷高、中、低劑量(40、20、10mg/(kg bw·d))組。采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型,缺血2h再灌注22h后,觀察腦組織病理學(xué)變化、測定髓過氧化物酶(MPO)活性,檢測細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)。結(jié)果:與模型組相比,甘草苷可明顯減輕腦組織病理學(xué)改變,降低MPO活性及ICAM-1表達(dá)。結(jié)論:甘草苷具有抗腦缺血再灌注炎性損傷活性。

      甘草苷;腦缺血再灌注;炎性損傷;髓過氧化物酶;細(xì)胞間黏附因子-1

      腦缺血是一種具有發(fā)病率高、致殘率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高等特點的腦血管疾病,而腦血管疾病與癌癥、心臟病一并構(gòu)成人類三大死亡原因[1-3]。目前,已有多種溶栓藥物被用于腦缺血治療,但伴隨著溶栓治療的進(jìn)展,強(qiáng)烈需求適合于抗腦缺血再灌注損傷藥物,以遏制再灌注所引起的腦組織的進(jìn)一步損傷[4]。研究表明腦缺血再灌注損傷與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載、細(xì)胞凋亡等有關(guān),其中炎癥反應(yīng)是研究熱點之一[5-6]。甘草中多種活性物質(zhì)被證實具有抗腦缺血再灌注損傷作用,但甘草中另一活性成分——甘草苷,雖已有研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、護(hù)肝、神經(jīng)及心臟保護(hù)等活性[7-12],然而目前尚無有關(guān)其抗腦缺血再灌注炎性損傷研究報道。

      本實驗擬采用線栓法制備小鼠大腦中動脈栓塞模型,研究甘草苷對腦缺血再灌注炎性損傷的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料、試劑與儀器

      雄性ICR小鼠,體質(zhì)量25~28g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2007-001。自然光照周期飼養(yǎng),術(shù)前12h禁食,自由飲水。

      甘草苷(純度≥98%) 天津尖峰天然產(chǎn)物公司;依達(dá)拉奉 南京先聲東元制藥有限公司;髓過氧化物酶(MPO)測試盒 南京建成生物工程研究所;細(xì)胞間黏附

      分子-1(ICAM-1)抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

      IX51倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司;多功能酶標(biāo)儀 Sigma公司;TGL 16M離心機(jī)湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;渦旋混合器 金壇市醫(yī)療器械廠。

      1.2 方法

      1.2.1 動物分組

      ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、 陽性對照組(依達(dá)拉奉3mg/(kg bw·d))和甘草苷高、中、低劑量(40、20mg/(kg bw·d)和10mg/(kg bw·d)組,每組8只。其中假手術(shù)組和模型組均灌胃給予等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉。各組動物均于手術(shù)前連續(xù)給藥3d,每天1次,第3天給藥1h后采用線栓法制備小鼠大腦中動脈栓塞模型。

      1.2.2 腦缺血再灌注模型制備

      將小鼠用4g/100mL水合氯醛(400mg/(kg bw·d))麻醉后,仰臥固定,常規(guī)消毒,沿頸部中線切開皮膚,分離皮下筋膜及肌肉組織。手術(shù)顯微鏡下分離左側(cè)頸總動脈(CCA)及其頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。根部結(jié)扎ECA,夾閉CCA和ICA。在CCA上開一小口,將魚線沿著CCA,穿過ICA和ECA分叉處進(jìn)入ICA。松開ICA,繼續(xù)將魚線插入到ICA顱內(nèi)段。自ICA起始部的插入長度約為1.2cm,表明線的頭端已穿過大腦中動脈起始部,結(jié)扎CCA和ICA。術(shù)中白熾燈加溫,維持小鼠肛溫約37℃。術(shù)后縫合傷口,動物回籠。缺血2h后拔出線栓至ECA和ICA分叉處,實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組小鼠僅施行手術(shù)而不插入魚線。

      1.2.3 組織病理學(xué)觀察

      缺血2h再灌22h后,將小鼠深度麻醉,迅速打開胸腔,暴露心臟,用鑷子捏住心臟,將針頭從心尖部位插入,向上進(jìn)針到升主動脈,用剪刀在右心房處剪一小口,灌注4g/100mL多聚甲醛,直至回流液變清后,斷頭取腦,去掉嗅球、小腦和低位腦干,然后冠狀切4刀,共5片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處,第二刀在視交叉部位,第三刀在漏斗柄部位,第四刀在漏斗柄與葉尾極之間,取視交叉部位與漏斗柄部位之間腦組織。用4g/100mL多聚甲醛固定24h,常規(guī)石蠟包埋,作連續(xù)切片,切片厚度為5μm,進(jìn)行常規(guī)HE染色,觀察病理形態(tài)學(xué)改變。

      1.2.4 腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定

      將小鼠斷頭取腦,去掉嗅球、小腦和低位腦干,然后冠狀切4刀,共5片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處,第二刀在視交叉部位,第三刀在漏斗柄部位,第四刀在漏斗柄與葉尾極之間,取視交叉部位與漏斗柄部位之間腦組織,利用試劑盒提供的勻漿介質(zhì),將腦組織制成10%的組織勻漿,按照MPO試劑盒說明書進(jìn)行操作。考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量。

      1.2.5 細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)檢測

      石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟,水化后,滴加ICAM-1一抗,按試劑盒說明書常規(guī)SABC法對標(biāo)本進(jìn)行染色,DAB顯色,蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)采集高倍(×400)視野,觀察ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞。

      1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

      采用SPSS13.0 For Windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)均以表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 組織病理學(xué)變化

      圖1 腦缺血再灌注小鼠腦組織病理學(xué)觀察(×400)Fig.1 Histopathological observation on mouse brain tissue with cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury (×400)

      由圖1可知,假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常,核膜清楚,未見神經(jīng)細(xì)胞變性壞死及間質(zhì)水腫等明顯病理變化。模型組神經(jīng)細(xì)胞及血管周圍間隙增大,間質(zhì)水腫明顯,形成軟化灶,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊,出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解、核體不規(guī)則。甘草苷處理組與模型組相比,組織病理學(xué)變化較輕,僅有輕微水腫,軟化灶減小,核固縮、核深染程度有不同程度減輕。結(jié)果表明甘草苷能減輕腦缺血再灌注小鼠腦組織損傷。

      2.2 腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性

      由表1可見,小鼠在腦缺血2h再灌注22h后,腦組織MPO活性明顯升高,模型組與假手術(shù)組相比差異顯著。與模型組比較,甘草苷高、中、低劑量組MPO活性顯著下降,并呈劑量依賴性,提示甘草苷可抑制中性粒細(xì)胞的浸潤。

      表1 甘草苷對小鼠腦缺血再灌注后MPO活性的影響(n=8)Table 1 Effect of liquiritin on MPO activity in mice after cerebral ischemia/reperfusion (n=8)

      2.3 細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)

      圖2 甘草苷對小鼠腦缺血再灌注后ICAM-1表達(dá)的影響(×400)Fig.2 Effect of liquiritin on ICAM-1 expression in mice after cerebral ischemia/reperfusion (×400)

      細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)陽性表達(dá)為胞漿呈棕黃色。由圖2可知,假手術(shù)組少見細(xì)胞陽性表達(dá)且呈弱陽性表達(dá),模型組陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量較多,表達(dá)強(qiáng)度也較強(qiáng)。與模型組相比,甘草苷各劑量組陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量減少,表達(dá)強(qiáng)度減弱。因此,甘草苷可有效抑制ICAM-1的表達(dá)。

      3 討 論

      目前,早期溶栓是治療腦缺血最有效的措施之一,但溶栓后再灌注所引起的并發(fā)癥限制著溶栓治療的推廣。研究表明,炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用,包括白細(xì)胞的激活浸潤和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)等,因此阻斷炎癥反應(yīng)是減輕腦缺血再灌注損傷的理想方法[13-15]。

      中性粒細(xì)胞嗜天青顆?;騿魏思?xì)胞中的髓過氧化物酶(MPO)可作為中性粒細(xì)胞的標(biāo)記物,利用其還原過氧化氫能力分析其活力,可反映中性粒細(xì)胞在組織中浸潤程度和分布,以定量反映炎性損傷程度。相關(guān)文獻(xiàn)報道腦缺血再灌注6h后,出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤,浸潤高峰出現(xiàn)在24~36h,6d后恢復(fù)正常[16-17]。本實驗結(jié)果表明缺血2h再灌注22h后,模型組MPO活性顯著升高,進(jìn)一步證實腦缺血再灌注后存在炎癥反應(yīng)。灌胃給予甘草苷治療,可明顯降低缺血再灌注后腦組織MPO活性,減輕中性粒細(xì)胞浸潤,抑制炎癥反應(yīng)。

      細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)是參與腦缺血炎癥反應(yīng)的重要因子,存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞,在缺血再灌注時表達(dá)增多。ICAM-1與白細(xì)胞受體作用接到白細(xì)胞的黏附及遷移,促進(jìn)白細(xì)胞缺血區(qū)浸潤。白細(xì)胞又能增加ICAM-1表達(dá),兩者相互作用,從而加重缺血再灌注后腦組織炎性損傷,形成惡性循環(huán)[18-19]。在本實驗中,與假手術(shù)組比較,模型組ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增加,表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng),再次驗證了腦缺血再灌注可促進(jìn)炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示,甘草苷能有效地抑制腦組織中ICAM-1的表達(dá),減輕腦缺血再灌注所引起的炎性損傷。

      總而言之,甘草苷可通過降低MPO活性及ICAM-1表達(dá)減輕腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮其抗腦缺血再灌注損傷作用。

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      Protective Effect of Liquiritin against Cerebral Ischemia/Reperfusion Inflammatory Injury in Mice

      SUN Ya-xuan1,2,LIU Ting3,DAI Xue-ling1,GAO Zhao-lan1,WEI Rong1,ZHENG Qiu-sheng3
      (1. College of Appllied Sciences and Humanities, Beijing Union University, Beijing 100191, China;2. Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China;3. Department of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832003, China)

      Objective: To investigate the protective effect and mechanism of liquiritin against cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury in mice. Methods: ICR mice were randomly divided into sham group, model group, positive control group (intraperitoneally administered edaravone, 3 mg/(kg bw·d)), and liquiritin groups (intragastrically administered, 40, 20 mg/(kg bw·d) and 10 mg/(kg bw·d)). Focal cerebral ischemia/reperfusion models were set up by using intraluminal filament method. After cerebral ischemia for 2 h and subsequent reperfusion for 22 h, histopathology changes were monitored, and the activity of MPO and the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in brain tissue were measured. Results: Compared with the model group, liquiritin noticeably decreased the activity of MPO and the expression of ICAM-1. Conclusion: Liquiritin has protective effects against cerebral ischemic/reperfusion inflammatory injury.

      liquiritin;cerebral ischemia/reperfusion;inflammatory injury;MPO;intercellular adhesion molecule-1

      R931.71

      A

      1002-6630(2010)23-0353-03

      2010-03-22

      北京聯(lián)合大學(xué)校級課題資助項目(zk200905x)

      孫雅煊(1970—),女,副教授,博士,研究方向為神經(jīng)生物學(xué)。E-mail:sunxx@ygi.edu.cn

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