• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    應(yīng)用PCR 技術(shù)快速測(cè)定食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力

    2010-03-23 05:36:31于豐宇王文斟劉曉朋
    食品科學(xué) 2010年23期
    關(guān)鍵詞:單增氏菌李斯特

    于豐宇,李 林,王 紅,王文斟,何 源,劉曉朋,凌 華

    (1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042)

    應(yīng)用PCR 技術(shù)快速測(cè)定食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌毒力

    于豐宇1,李 林1,王 紅2,王文斟2,何 源2,劉曉朋2,凌 華2

    (1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042)

    目的:采用PCR技術(shù)準(zhǔn)確、快速測(cè)定單核細(xì)胞增生李斯特菌(單增李斯特氏菌)分離株的毒力基因,鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株或無(wú)毒株,以有效地限制李斯特氏菌病的傳播。方法:以單增李斯特氏菌相關(guān)毒力基因(hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA)設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)重慶市2007—2009年分離的40株單增李斯特氏菌分離株中的毒力基因攜帶率,并進(jìn)行小鼠毒力實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:40株分離株中有15株7種毒力基因檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,6株hly基因陰性,4株plcB基因陰性,4株prfA基因陰性,5株inlA、inlB基因陰性,11株inlC基因陰性,9株inlJ基因陰性,1株inlA、inlB、inlC、inlJ基因均為陰性。4株分離株的毒力與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC191161E相當(dāng),小鼠LD50在1.2×108~6.0×108CFU/mL之間,為強(qiáng)毒株。篩選出弱毒株09-132,LD50為1.7×1011CFU/mL。結(jié)論:重慶市存在發(fā)生李斯特菌食物中毒的潛在危險(xiǎn),內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是導(dǎo)致菌株毒力降低的原因,而prfA和plcB基因與菌株毒力的相關(guān)性較小。

    單核細(xì)胞增生李斯特菌;毒力;基因;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

    單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特氏菌)屬于李斯特氏菌屬(Listeria),是一種人畜共患的病原菌,可穿越宿主三道屏障,引起人和動(dòng)物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等,發(fā)病率不高,死亡率可達(dá)20%~30%[1]。自1926年首次分離出單增李斯特氏菌后,李斯特氏菌病現(xiàn)已呈世界性分布。近年來(lái)隨著人們生活節(jié)奏的加快,我國(guó)冷藏、速凍食品消費(fèi)量迅速增多,食品中單增李斯特氏菌的潛在危險(xiǎn)性也越來(lái)越大。目前,美國(guó)、歐盟等一些國(guó)家對(duì)食品中單增李斯特氏菌的污染非常重視,我國(guó)近年也將食品中單增李斯特氏菌的污染檢測(cè)作為一項(xiàng)必檢的安全指標(biāo)。由于不同來(lái)源的單增李斯特氏菌毒力差異較大,

    有些菌株致病性很強(qiáng),而有些菌株毒力較弱甚至無(wú)致病性[2],因此準(zhǔn)確、快速測(cè)定單增李斯特氏菌分離株的毒力具有重大意義,其可有效地限制李斯特氏菌病的傳播以及減少不必要的食品召回。

    單增李斯特氏菌致病力的測(cè)定包括小鼠毒力實(shí)驗(yàn)、體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和毒力相關(guān)蛋白及基因的檢測(cè)。小鼠毒力實(shí)驗(yàn)為體內(nèi)檢測(cè)細(xì)菌致病力的方法,是其他毒力檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn),但實(shí)驗(yàn)成本高、且耗時(shí),體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相對(duì)于小鼠毒力實(shí)驗(yàn)成本較低,且操作簡(jiǎn)便,雖然具有重要的細(xì)菌毒力預(yù)測(cè)價(jià)值但相對(duì)費(fèi)時(shí)。隨著單增李斯特氏菌及無(wú)害李斯特氏菌全基因組序列的測(cè)定,己鑒定出若干新的毒力相關(guān)基因,使通過(guò)基因檢測(cè)測(cè)定單增李斯特氏菌的致病力成為可能。Liu等[3]借助比較基因組學(xué)方法分析強(qiáng)毒株中特有的毒力基因lmo2821、lmo0733,建立了相應(yīng)的PCR方法以鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株(或無(wú)毒株)。

    本實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù),對(duì)重慶市2007—2009年分離到的40株單增李斯特氏菌食品分離株進(jìn)行毒力基因檢測(cè),分析不同食品樣品中菌株的毒力基因攜帶情況,并結(jié)合小鼠毒力實(shí)驗(yàn),鑒別強(qiáng)毒株和弱毒株或無(wú)毒株,擬建立相應(yīng)的評(píng)估指標(biāo),為該病原菌的監(jiān)控、預(yù)警及爆發(fā)食物中毒后追蹤感染源及傳播途徑提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與試劑

    單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 54004和 ATCC 191161E 由重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所提供。40株單增李斯特氏菌自重慶市各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的生鮮食品中分離所得,均經(jīng)GB/T4789.30—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)確認(rèn)。

    Taq DNA 聚合酶、dNTP 寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖 TaKaRa 公司;API Listeria 生化鑒定試劑條 法國(guó)生物梅里埃公司;李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基 鄭州博賽公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    ICR小鼠(雌性,體質(zhì)量20~22g)由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    PTC-200 核酸擴(kuò)增儀 美國(guó)MJ 公司;TGL-16高速臺(tái)式離心機(jī) 南京艾賽特科技發(fā)展有限公司;DYY-11型電泳儀 杭州匯爾儀器有限公司;Chemi DocXRS凝膠成像儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;微量移液器 法國(guó)吉爾森公司。

    1.2 PCR 方法

    1.2.1 引物合成

    針對(duì)單增李斯特氏菌的hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA基因選取7 對(duì)特異性引物[4-8],委托生工生物工程(上海)有限公司合成,其序列見(jiàn)表1。

    表1 單增李斯特氏菌相關(guān)毒力基因的引物Table 1 Primers used in the PCR assay forL. monocytogenesgenes

    1.2.2 模板DNA 制備

    將待檢菌株劃線(xiàn)接種腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)24h,挑取菌落溶于1mL無(wú)菌純水的離心管中制成濃菌懸液,100℃煮沸10min,12000r/min離心5min,取上清保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)

    反應(yīng)體系:模板DNA 2μL、10μmol/L上下游引物各1μL、各25mmol/L dNTP 1μL、5U/μL Taq 酶0.2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、10×buffer 2.5μL、純水15.8μL,總體積25μL。

    PCR 反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性10min;再按94℃變性1min,退火20s (退火溫度按表1),72℃延伸20s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8min。

    1.2.4 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳

    將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及100bp DNA Ladder Marker分別上樣5μL,電泳。膠塊在溴化乙錠中浸泡20min,觀察電泳結(jié)果,并對(duì)其進(jìn)行分析。

    1.3 小鼠LD50實(shí)驗(yàn)

    將待檢菌株過(guò)夜培養(yǎng)物8000r/min離心5min以收集菌體。沉淀用PBS反復(fù)離心漂洗3次,用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)喳準(zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),調(diào)節(jié)菌濃度至約1×108CFU/mL,并進(jìn)行一系列的10倍梯度稀釋?zhuān)桨逵?jì)數(shù)以確定實(shí)際接種量。同時(shí)選取不同的稀釋度腹腔接種于ICR雌性小鼠,劑量為0.2mL,每組接種6只

    小鼠,共4組,并分別于接種后每隔12h進(jìn)行一次觀察,連續(xù)觀察7d,以Karber法[9]計(jì)算LD50。

    1.4 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

    血清分型是一種傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法。根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H 抗原,可將單增李斯特氏菌分為16 個(gè)血清型:1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b 和7。參照單增李斯特氏菌診斷血清使用說(shuō)明書(shū),O抗原采用玻片凝集法,H抗原采用試管凝集法。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

    表2 單增李斯特氏菌毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR results of virulence-associated genes ofListeria monocytogenes

    單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)株及40株單增李斯特氏菌分離株毒力基因PCR 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

    由表2可知,40株單增李斯特氏菌分離株中有15株7種毒力基因檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,6株hly基因陰性,4株plcB基因陰性,4株prfA基因陰性,5株inlA、inlB基因陰性,11株inlC基因陰性,9株inlJ基因陰性,其中有1株inlA、inlB、inlC、inlJ基因均為陰性。結(jié)合菌株來(lái)源分析,可知生禽肉中單增李斯特氏菌內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)陽(yáng)性率高于生畜肉。各基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1~7。

    圖1 hly的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofhly

    圖2 plcB的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofplcB

    圖3 inlA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlA

    圖4 prfA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofprfA

    圖5 inlB的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlB

    圖6 inlC的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlC

    圖7 inlJ的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Agarose gel electrophoregrams of PCR amplification products ofinlJ

    2.2 小鼠毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    從40株單增李斯特氏菌分離株中選取21株毒力基因攜帶具有差異性的菌株進(jìn)行小鼠毒力實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 小鼠毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of toxicity test in mice

    如表3所示,番茄分離株09-132毒力最弱(LD50為1.7×1011CFU/mL)。有4株單增李斯特氏菌分離株(08-32、09-137、09-116、09-465)的毒力與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC191161E相當(dāng),LD50在1.2×108~6.0×108CFU/mL之間。其他分離株的毒力弱于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC191161E,LD50介于2.1×109~7.3×1010CFU/mL之間。

    2.3 單增李斯特氏菌毒力基因與毒力的相關(guān)性分析

    食品分離株的毒力強(qiáng)弱與血清型無(wú)關(guān)。一般研究認(rèn)為,食源性李斯特氏菌病發(fā)生多由血清4b型引起,其次是1/2a、1/2b[10],但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)少數(shù)4d、4c血清型菌株的毒力強(qiáng)于4b、1/2a及1/2b血清型的菌株,它們同樣具有引起食源性李斯特氏菌病發(fā)生的可能性。通過(guò)血清分型來(lái)排除弱毒株的方法是不可行的。

    從速凍食品中分離出的單增李斯特氏菌,發(fā)現(xiàn)有特異型缺乏hly、prfA的菌株,但這些菌株的毒力與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的毒力相比沒(méi)有明顯降低,可能是變異產(chǎn)生了其他未知的毒力因子,有待于進(jìn)一步研究。 有一株生肉中分離出的單增李斯特氏菌(07-140),缺失hly、plcB、inlC、inlJ、prfA基因,小鼠LD50為 6.0×109CFU/mL,其毒力較強(qiáng)毒株ATCC191161E(2.5×108CFU/mL)略低,可見(jiàn)inlA、inlB所產(chǎn)生的毒力因子對(duì)菌株致病力的貢獻(xiàn)較大。

    缺失plcB基因的菌株毒力(6.0×108CFU/mL)較其他毒力基因攜帶完整的菌株略低,但不存在顯著的相關(guān)性。

    內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)缺失的菌株與攜帶完整毒力基因的菌株相比相對(duì)毒力差異較大,內(nèi)化素基因的缺失可能是導(dǎo)致菌株毒力降低的原因,缺失不同內(nèi)化素基因的菌株毒力差異見(jiàn)表4。

    表4 缺失不同內(nèi)化素基因的菌株毒力Table 4 Mouse virulence ofListeria monocytogenesstrains losing different internalized genes

    由表4可知,內(nèi)化素基因inlA、inlB、inlJ、inlC與菌株毒力存在顯著相關(guān)性,inlC對(duì)菌株毒力的影響較大,可作為區(qū)分強(qiáng)毒株和弱毒株的標(biāo)志基因。但不同內(nèi)化素基因與毒力的相關(guān)性還需進(jìn)一步研究。

    3 討 論

    單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為一嗜冷菌,能在食品低溫冷藏過(guò)程中生長(zhǎng)繁殖。美國(guó)每年大約有2500人因感染單增李斯特氏菌繼發(fā)嚴(yán)重的疾病,大約有500人死亡[11]。我國(guó)食品污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)從2000 年起開(kāi)展對(duì)食品中單增李斯特氏菌的監(jiān)測(cè),隨著對(duì)該菌的重視和檢測(cè)技術(shù)的提高,食品中單增李斯特氏菌的檢出率明顯提高。

    實(shí)驗(yàn)中有2株分離株API Listeria生化試劑條結(jié)果為單增李斯特氏菌,但7種毒力基因均未被檢測(cè)到,因此認(rèn)為此兩株菌可能是單增李斯特氏菌,未將其計(jì)入實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)??梢?jiàn)傳統(tǒng)的生化檢驗(yàn)并不完全準(zhǔn)確,單增李斯特氏菌的毒力基因檢測(cè)可以是傳統(tǒng)鑒定方法的一個(gè)補(bǔ)充,建立PCR方法檢測(cè)毒力基因?qū)焖僭\斷食物中毒具有現(xiàn)實(shí)意義。

    目前有關(guān)報(bào)道表明所有致病性的單增李斯特氏菌都含有inlA、inlB[12-13],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示同時(shí)含有inlA、inlB內(nèi)化素基因的菌株約占89.7%,可見(jiàn)該地區(qū)存在著該菌引起李斯特氏菌病的潛在危險(xiǎn),尤其是速凍食品、肉制品和水產(chǎn)品中同時(shí)含有inlA、inlB的菌株所占比例較大,番茄中的單增李斯特氏菌不含有inlA、inlB,自然界中可能存在已發(fā)生變異的非典型的單增李斯特氏菌,缺失或改變了這些基因,這些變異對(duì)它的生存、繁殖、致病性等方面到底有何影響需要進(jìn)一步研究。

    隨著inlA、inlB、inlC、inlJ天然缺失株的出現(xiàn),可以推測(cè)單增李斯特氏菌某些對(duì)致病力起決定作用的毒力基因正在消失。病原菌這種向著毒力減弱或消失方向進(jìn)化的例子比較罕見(jiàn)。但從理論上講,像單增李斯特氏菌這樣亦可在自然界(如水、土壤、植物等) 自由生活的細(xì)菌,與致病力相關(guān)的基因?qū)ζ洳⒎潜匦?,將其缺失并不影響?xì)菌的生存與增殖[14],因此這樣的基因片段可以看作一種不必要的負(fù)荷,即“基因垃圾”;在自然選擇的壓力下,這種垃圾基因可能會(huì)被清除,以使細(xì)菌能更好地適應(yīng)生存環(huán)境。

    [1]柳增善. 食品病原微生物學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2007: 258.

    [2]JIANG Lingli, CHEN Jianshun, XU Jingjing, et al. Virulence characterization and genotypic analyses of Listeria monocytogenes isolates from food and processing environments in eastern China[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(1): 53-59.

    [3]LIU Dongyou, LAWRENCE M L, AINSWORTH A J, et al. Toward an improved laboratory definition of Listeria monocytogenes virulence[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 118: 101-115.

    [4]胡楊峰. 食源性單核增生性李斯特氏菌分布及其內(nèi)化素基因分布研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

    [5]RAWOOL D, MALIK S, SHAKUNTALA I, et al. Detection of multiple virulence-associated genes in Listeria monocytogenes isolated from bovine mastitis cases[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 113(2): 201-207.

    [6]張輝, 王興龍. 食品中單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌PCR快速檢測(cè)[J].食品科學(xué), 2008, 29(4): 324-327.

    [7]陳巧妙, 陳健舜, 吳迪天, 等. 天然缺失inlAB的非典型單核細(xì)胞增多性李斯特菌生物學(xué)特性鑒定[J].微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(8): 1033-1039.

    [8]RODRIGUEZ-LAZARO D, JOFRE A, AYMERICH T, et al. Rapid quantitative detection of Listeria monocytogenes in meat products by real-time PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70: 6299-6301.

    [9]LIU Dongyou. Listeria monocytogenes: comparative interpretation of mouse virulence assay[J]. FEMS Micro-Biology Letters, 2004, 233(1): 159-164.

    [10]ZHOU Xiaohui, JIAO Xinan. Molecular grouping and pathogenic analysis of Listeria monocytogenes of clinical and food origin[J]. Food Control, 2005, 16: 867-872.

    [11]KESSEL J S V, KARNS J S, GORSKI L, et al. Prevalence of Salmonellae, Listeria monocytogenes, and fecal coliforms in bulk tank milk on US dairies[J]. Journal Dairy Science, 2004, 87(9): 2822-2830.

    [12]祝仁發(fā), 葉長(zhǎng)蕓. 單核細(xì)胞增生李斯特菌的毒力因子[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2007, 19(2): 158-162.

    [13]陳健舜, 江玲麗, 方維煥. 李斯特菌毒力因子及其進(jìn)化[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2007, 47(4): 738-742.

    [14]RAGON M, WIRTH T, HOLLANDT F, et al. A new perspective on Listeria monocytogenes evolution[J]. Plos Pathog, 2008, 4(9): e1000146 (1-14).

    Rapid PCR Detection of Listeria monocytogenes Virulence in Food

    YU Feng-yu1,LI Lin1,WANG Hong2,WANG Wen-zhen2,HE Yuan2,LIU Xiao-peng2, LING Hua2
    (1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Chongqing Center for Disease Control and Prevention, Chongqing 400042, China)

    Objective: The virulence-associated genes of Listeria monocytogenes (L.m) isolates were detected by PCR amplification assay in order to provide experimental

    for evaluating the virulence of L.m isolates and effectively limiting the transmission of L.m. Methods: Forty strains of L.m isolated in Chongqing from 2007 to 2009 were subjected to the PCR detection of seven virulence-associated genes (hly, plcB, inlA, inlB, inlC, inlJ, prfA) and toxicity test in mice. Results: The PCR assay revealed that 15 of the 40 L.m isolates possessed all the seven virulence-associated genes, 6 strains were hly-, 4 strains were plcB-, 4 strains were prfA-, 5 strains were inlA-, inlB-, 11 strains were inlC-, 9 strains were inlJ-, and 1 strain was negative for inlA, inlB, inlC and inlJ. Four isolates were defined as virulent strains, whose virulence was equivalent to the standard strain, ATCC 1961E with a mouse LD50 between 1.2 × 108CFU/mL and 6.0 × 108CFU/mL. The LD50 of the screened low virulent strain 09-132 was 1.7 × 1011CFU/mL . Conclusions: There is a potential risk of Listeria food poisoning in Chongqing City, and the internalized gene (inlA, inlB, inlC, inlJ) loss may lead to virulence declination, while the prfA and plcB genes are less relevant to the virulent isolates.

    Listeria monocytogenes;virulence;gene;PCR

    TS 207.7

    A

    1002-6630(2010)23-0164-05

    2010-08-02

    于豐宇(1985— ),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail:1985yufengyu@163.com

    猜你喜歡
    單增氏菌李斯特
    我國(guó)華東與華南地區(qū)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)遲緩愛(ài)德華氏菌分離株的多樣性分析
    冰箱囤貨要警惕這個(gè)“搗蛋分子”
    冰箱里的“殺手”
    黨員文摘(2022年1期)2022-04-03 21:37:19
    我請(qǐng)鴿子來(lái)吃飯
    幼兒園(2019年7期)2019-09-05 17:49:18
    基于PasteurMLST網(wǎng)站分析中國(guó)單增李斯特菌克隆復(fù)合體的多樣性
    飼料維生素C含量對(duì)半滑舌鰨抵抗遲緩愛(ài)德華氏菌感染的影響
    Tn7轉(zhuǎn)座子在大腸桿菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌及鰻弧菌中的應(yīng)用
    保持肅靜
    三重LAMP法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌
    單核細(xì)胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分離鑒定及其抑菌活性
    麻豆av在线久日| 免费观看人在逋| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久精品人妻少妇| 动漫黄色视频在线观看| 色播在线永久视频| 黄片播放在线免费| 国产日本99.免费观看| 国产午夜精品久久久久久| 丁香欧美五月| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av五月六月丁香网| 国内精品久久久久精免费| 午夜免费激情av| 亚洲第一av免费看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 757午夜福利合集在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲avbb在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲av熟女| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久狼人影院| 男人舔女人的私密视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中文在线观看免费www的网站 | 一区二区三区精品91| 亚洲国产欧美一区二区综合| 淫秽高清视频在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 91成人精品电影| 久热爱精品视频在线9| 岛国在线观看网站| 丝袜在线中文字幕| 久久亚洲精品不卡| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| 露出奶头的视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩免费av在线播放| 悠悠久久av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 男男h啪啪无遮挡| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲avbb在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产日本99.免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲午夜理论影院| 精品久久久久久久久久久久久 | 91麻豆av在线| 久久精品91无色码中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产三级在线视频| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲国产精品合色在线| 欧美乱色亚洲激情| 欧美日本视频| 高清在线国产一区| √禁漫天堂资源中文www| 在线观看免费午夜福利视频| 精品久久久久久久末码| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 波多野结衣巨乳人妻| 制服人妻中文乱码| www.精华液| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产色视频综合| 国产精品av久久久久免费| 久久精品影院6| 88av欧美| 长腿黑丝高跟| 91麻豆精品激情在线观看国产| avwww免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线视频色国产色| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 婷婷精品国产亚洲av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日韩精品青青久久久久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品第一国产精品| 日韩欧美国产在线观看| 久久九九热精品免费| 高清毛片免费观看视频网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品欧美一区二区三区在线| 老司机福利观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产97色在线日韩免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产成人av激情在线播放| 国产久久久一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩有码中文字幕| 免费在线观看黄色视频的| 国产成人欧美在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| tocl精华| 久久香蕉激情| 视频在线观看一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲av五月六月丁香网| 又紧又爽又黄一区二区| 最新美女视频免费是黄的| 十分钟在线观看高清视频www| 在线av久久热| 一边摸一边抽搐一进一小说| 一级片免费观看大全| 国产精品av久久久久免费| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久精品欧美日韩精品| 国产一区二区激情短视频| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲无线在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 午夜福利18| 国产不卡一卡二| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久中文看片网| АⅤ资源中文在线天堂| 久久香蕉国产精品| 淫秽高清视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 亚洲第一青青草原| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美黑人精品巨大| 色在线成人网| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产乱人伦免费视频| 手机成人av网站| 少妇 在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 91九色精品人成在线观看| 免费观看精品视频网站| 国产成人av激情在线播放| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品野战在线观看| 黄片播放在线免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 男女那种视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 人人澡人人妻人| 日韩欧美国产在线观看| 我的亚洲天堂| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品久久久久久,| 黄片小视频在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 99久久国产精品久久久| 欧美中文日本在线观看视频| 99热6这里只有精品| 国产单亲对白刺激| 日韩欧美在线二视频| 黄片播放在线免费| 91在线观看av| 欧美不卡视频在线免费观看 | 免费观看精品视频网站| 亚洲第一电影网av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 男女那种视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | x7x7x7水蜜桃| 成熟少妇高潮喷水视频| 禁无遮挡网站| 国产精品精品国产色婷婷| 男人的好看免费观看在线视频 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜久久久在线观看| www国产在线视频色| 精品久久久久久久久久久久久 | av免费在线观看网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 18禁观看日本| 美女大奶头视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品国产清高在天天线| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲av熟女| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美黑人巨大hd| 国产精华一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日本视频| av免费在线观看网站| 亚洲专区中文字幕在线| 在线免费观看的www视频| av欧美777| 亚洲av成人av| or卡值多少钱| 日韩大码丰满熟妇| 精品欧美一区二区三区在线| 观看免费一级毛片| 一区二区三区国产精品乱码| 韩国av一区二区三区四区| 成年版毛片免费区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲成人久久性| 亚洲美女黄片视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品成人免费网站| 99在线视频只有这里精品首页| 女人被狂操c到高潮| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产成+人综合+亚洲专区| 婷婷精品国产亚洲av| 999久久久精品免费观看国产| 国产男靠女视频免费网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产三级黄色录像| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久国产成人免费| 成人三级做爰电影| 黄片播放在线免费| 欧美不卡视频在线免费观看 | 成人精品一区二区免费| 亚洲一区中文字幕在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 禁无遮挡网站| 桃色一区二区三区在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲成人久久性| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 精品欧美国产一区二区三| 日韩欧美国产在线观看| 成人国产综合亚洲| 免费看a级黄色片| 黄色视频不卡| 国产色视频综合| 日韩大码丰满熟妇| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日本视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 1024香蕉在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一a级毛片在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久久久久中文| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲激情在线av| 国产精品久久视频播放| 国产激情久久老熟女| 不卡av一区二区三区| 欧美在线黄色| 夜夜爽天天搞| 国产色视频综合| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩国内少妇激情av| 亚洲真实伦在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 美女 人体艺术 gogo| 麻豆一二三区av精品| 一区二区三区高清视频在线| 免费高清视频大片| 亚洲成av人片免费观看| xxx96com| 国产成人欧美| 国产成年人精品一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 天堂影院成人在线观看| 一区二区三区激情视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 操出白浆在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产一区二区激情短视频| 国产真实乱freesex| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成人免费观看视频高清| av片东京热男人的天堂| 免费无遮挡裸体视频| 在线永久观看黄色视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | av免费在线观看网站| 国产不卡一卡二| 精品久久久久久久末码| 九色国产91popny在线| 麻豆成人av在线观看| 午夜a级毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲九九香蕉| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲 欧美一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美性猛交黑人性爽| 国产熟女午夜一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 男人舔女人的私密视频| videosex国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美乱色亚洲激情| 在线观看一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产真实乱freesex| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲全国av大片| av有码第一页| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产免费av片在线观看野外av| 精品欧美国产一区二区三| 免费在线观看日本一区| av天堂在线播放| 69av精品久久久久久| 亚洲avbb在线观看| 午夜激情av网站| 久久精品国产清高在天天线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩国内少妇激情av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产伦人伦偷精品视频| 人妻久久中文字幕网| 手机成人av网站| 午夜福利一区二区在线看| 俺也久久电影网| 一级毛片女人18水好多| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人av教育| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲中文av在线| 日本一区二区免费在线视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品国产一区二区三区四区第35| 夜夜爽天天搞| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久人妻av系列| 欧美不卡视频在线免费观看 | av欧美777| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 大型黄色视频在线免费观看| 露出奶头的视频| 免费看日本二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产av不卡久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产亚洲精品一区二区www| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩大码丰满熟妇| 国产成人精品久久二区二区免费| 一级a爱片免费观看的视频| 男女视频在线观看网站免费 | 国产高清videossex| 999久久久国产精品视频| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲天堂国产精品一区在线| 大型黄色视频在线免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久久久久久精品吃奶| 日日夜夜操网爽| av天堂在线播放| 视频在线观看一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 国产主播在线观看一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产野战对白在线观看| 国产精品久久视频播放| 最新美女视频免费是黄的| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美日韩乱码在线| 精品久久久久久久久久久久久 | 日韩三级视频一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲成人国产一区在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| xxxwww97欧美| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一个人免费在线观看的高清视频| 一本精品99久久精品77| 色在线成人网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲自偷自拍图片 自拍| www.999成人在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 免费在线观看影片大全网站| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲第一电影网av| 97碰自拍视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久 成人 亚洲| 草草在线视频免费看| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 午夜日韩欧美国产| 欧美日本视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产日本99.免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 香蕉丝袜av| 脱女人内裤的视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲精品久久国产高清桃花| 麻豆一二三区av精品| 国产91精品成人一区二区三区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 中国美女看黄片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 淫秽高清视频在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 最好的美女福利视频网| 成年人黄色毛片网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕久久专区| 国产又爽黄色视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲在线自拍视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 午夜精品在线福利| 国产精品98久久久久久宅男小说| 视频区欧美日本亚洲| 黑人欧美特级aaaaaa片| 两个人免费观看高清视频| 热99re8久久精品国产| 久久精品91蜜桃| 免费搜索国产男女视频| 真人做人爱边吃奶动态| 99精品欧美一区二区三区四区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 午夜影院日韩av| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产视频一区二区在线看| 日韩高清综合在线| 久久 成人 亚洲| 99热只有精品国产| 国产av一区在线观看免费| 身体一侧抽搐| 久久久久久国产a免费观看| 我的亚洲天堂| 免费电影在线观看免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产真人三级小视频在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 人成视频在线观看免费观看| 美国免费a级毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av美国av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 黄色a级毛片大全视频| 亚洲激情在线av| www.精华液| avwww免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品国产区一区二| 国产成人影院久久av| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产成+人综合+亚洲专区| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美大码av| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 美女免费视频网站| 操出白浆在线播放| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费无遮挡裸体视频| 欧美zozozo另类| 亚洲色图av天堂| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 色播在线永久视频| 久久久国产精品麻豆| 看片在线看免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 一级毛片女人18水好多| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产乱人伦免费视频| 美女高潮到喷水免费观看| 国产99久久九九免费精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 看免费av毛片| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜福利18| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜久久久久精精品| 男女下面进入的视频免费午夜 | av片东京热男人的天堂| 久久久久久九九精品二区国产 | 好男人在线观看高清免费视频 | 69av精品久久久久久| 日韩精品中文字幕看吧| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美乱色亚洲激情| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美午夜高清在线| 一本精品99久久精品77| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 国产免费av片在线观看野外av| √禁漫天堂资源中文www| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品久久久久久成人av| avwww免费| 日本在线视频免费播放| 黄色女人牲交| 中文字幕最新亚洲高清| 在线永久观看黄色视频| 91麻豆av在线| 国产精品久久久av美女十八| 精品午夜福利视频在线观看一区| av欧美777| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本 av在线| 高清在线国产一区| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 人成视频在线观看免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产视频一区二区在线看| 最近在线观看免费完整版| 男人舔奶头视频| 亚洲欧美激情综合另类| 美女大奶头视频| 日本三级黄在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 麻豆一二三区av精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 搞女人的毛片| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| www.www免费av| 老司机靠b影院| 免费在线观看成人毛片| 亚洲自拍偷在线| 午夜久久久在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 波多野结衣高清作品| 色播在线永久视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 免费无遮挡裸体视频| 国产精华一区二区三区| 日韩免费av在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产野战对白在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 香蕉av资源在线| 免费观看精品视频网站| or卡值多少钱| 婷婷亚洲欧美| 成人手机av| 久久精品人妻少妇| 国产v大片淫在线免费观看|