耐高溫β-半乳糖苷酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)分析

高兆建，侯進慧，孫會剛，刁進進

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

耐高溫β-半乳糖苷酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)分析

高兆建，侯進慧，孫會剛，刁進進

(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

為從嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)XG24發(fā)酵液中純化到β-半乳糖苷酶，并對酶學(xué)性質(zhì)進行研究，利用硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析等方法進行分離純化。結(jié)果表明：經(jīng)過系列步驟純化后，酶純度提高了54.5倍，回收率20.4%，酶比活力達(dá)32.7U/mg。以鄰-硝基酚-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)為底物，研究β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。最適pH6.5，最適作用溫度65℃。此菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶在70℃以下和pH4.0～8.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；Mg2+、Mn2+、Fe2+和Co2+對此酶有明顯激活作用，而Cu2+、Ag+、Hg2+幾乎完全抑制酶活性。以O(shè)NPG為底物酶的Km值為4.32mmol/L。SDS-PAGE和凝膠過濾層析測得酶蛋白為單肽鏈蛋白，表觀分子質(zhì)量64kD。因此，嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶在乳制品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值。

嗜熱脂肪芽孢桿菌；β-半乳糖苷酶；分離純化；性質(zhì)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC 3.2.1.23)，又稱乳糖酶，能夠催化β-D-半乳吡喃糖苷水解或者轉(zhuǎn)糖基化。該酶廣泛存在于各種動物、植物、細(xì)菌、酵母、真菌或霉菌中[1-3]。β-半乳糖苷酶將牛乳或其他乳制品中的乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，降低乳制品中乳糖含量，提高乳制品的可消化性[4-5]，廣泛用于低乳糖牛奶和非結(jié)晶型濃縮牛奶的生產(chǎn)，解決世界一半以上人口存在的乳糖不耐癥問題[6]，β-半乳糖苷酶還具有半乳

糖苷轉(zhuǎn)移作用，用于生產(chǎn)雙歧因子-低聚半乳糖[7-8]，從而在益生菌食品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。β-半乳糖苷酶在食品中的重要應(yīng)用價值引起人們對它的廣泛關(guān)注。由于微生物的快速生長、高效代謝以及分離純化相對簡單等優(yōu)勢，使微生物β-半乳糖苷酶成為工業(yè)化酶制劑的主要來源。目前乳品工業(yè)用于分解乳糖的β-半乳糖苷酶多從經(jīng)誘導(dǎo)的酵母、米曲霉、黑曲霉或乳酸菌產(chǎn)酶后提取獲得，但是均存在熱穩(wěn)定性差的缺點，嚴(yán)重限制了它在乳制品中的應(yīng)用。采用高溫型β-半乳糖苷酶能夠克服這缺陷。酶在60℃以上溫度水解乳糖，可以有助于抑制雜菌微生物的生長，而且酶反應(yīng)速度快，酶用量低，反應(yīng)時間短，生產(chǎn)中可與巴氏殺菌同時進行或冷卻階段保溫水解。因此，乳糖酶的研究日益引起人們的重視[9]。

目前，已經(jīng)篩選分離了多種β-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌[10]、乳酸菌屬[11]、芽孢桿菌屬[12]、曲霉菌屬[13]等系列菌株。但是，大部分β-半乳糖苷酶的pH值穩(wěn)定范圍較窄，穩(wěn)定性較差。故研究熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶成為研究的熱點，如海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)[14]，嗜熱古細(xì)菌(Pyrococcus woesei)[15]，嗜熱棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)[16]。但對于嗜熱脂肪芽孢桿菌β-半乳糖苷酶國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。本實驗室從溫泉附近土壤中篩選到一株極高耐熱性的嗜熱脂肪芽孢桿菌，初步研究發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)β-半乳糖苷酶耐熱性強、酶活性高。對酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)研究為今后從分子與結(jié)構(gòu)水平研究β-半乳糖苷酶的耐熱機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DEAE-Sephrose Fast Flow、Sephadex G-75 瑞典Amersham Pharmacia公司；考馬斯亮藍(lán)、TEMED、聚丙烯酰銨 美國Amresco公司；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 上海生物工程公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng) 瑞典Aamersham Pharmacia Biotech公司；蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；CR21G II立式冷凍離心機 日本日立公司。

1.2 菌種

β-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌株由本實驗室從溫泉附近土壤中分離篩選得到。經(jīng)鑒定并命名為B a c i l l u s stearothermophilus XG24。

1.3 培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件

接種適量的嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24菌懸液于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(乳糖2g、蛋白胨2g、CaCl20.01g、MgSO4·7H2O 0.001g、KH2PO40.1g、酵母浸膏0.2g、NaCl 0.015g、FeSO4·7H2O 0.001g、MnSO4·4H2O 0.001g、蒸餾水100mL)，pH6.8，45℃，150r/min培養(yǎng)42h。發(fā)酵培養(yǎng)物在4℃條件下8000r/min離心15min，去除細(xì)胞，上清液作為粗酶液進行下面的分離純化操作。

1.4 酶的分離純化

將500mL粗酶液在冰浴中邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末至40%飽和度，4℃靜置鹽析4h后8000r/min離心30min，取上清液繼續(xù)加入硫酸銨至70%的飽和度，再次離心后收集沉淀，重新溶于30mL 20mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.5)中，并用相同的緩沖溶液徹底透析脫鹽。將上述經(jīng)透析脫鹽后的酶液，12000r/min離心30min后，上清液加到已用緩沖液A平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow (2.5cm×30cm)陰離子交換柱上，先用不含NaCl的緩沖溶液A洗脫，直到洗至A280nm在0.02以下時，再用0～1.0mol/L的NaCl進行線性梯度洗脫。含酶組分合并后用聚乙二醇20000包埋法濃縮至2mL，再上Sephadex G-75(1.6cm×90cm)分子篩凝膠柱，用含0.02mol/L NaCl的20mmol/L磷酸緩沖溶液(pH6.5)進行洗脫，收集有酶活性部分檢測酶純度及用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1.5 酶活性測定

參考Gul-Guven等[11]的方法，并略有改動。取500μL待測酶液加入到已經(jīng)預(yù)熱到65℃的1.5mL含有2mmol/L ONPG的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)中，65℃水浴保溫10min后，加入1mL 1mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于405nm波長處測定吸光度，計算水解產(chǎn)物鄰硝基酚的含量和酶的活性，同時以0.1mol/L pH6.5磷酸緩沖液代替酶液作為對照。乳糖酶活性的定義：1個單位的乳糖酶的活性為在pH6.5，65℃條件下每分鐘分解ONPG生成lμmol鄰硝基酚(ONP)所需的酶量。

1.6 蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定采用Lowry法[17]，以牛血清白蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對蛋白質(zhì)濃度進行定量。

1.7 分子質(zhì)量的測定

1.7.1 凝膠過濾法

藍(lán)色葡聚糖上樣Sephadex G-75凝膠色譜柱，測定柱空隙體積(V0)，然后上樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白及樣品蛋白，測定各蛋白的洗脫體積(Ve)，以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積同柱空隙體積的比率(Ve/V0)同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量對數(shù)(lgMW)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出該β-半乳糖苷酶的表觀分子質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、兔肌動蛋白、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.7.2 SDS-PAGE電泳

按Laemmli等[18]的方法進行SDS-PAGE電泳，分離膠10%，濃縮膠5%。將樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白(兔磷酸化酶B (97400D)、牛血清白蛋白(66200D)、兔肌動蛋白

(43000D)、牛碳酸酐酶(31000D)、胰蛋白酶抑制劑(20100D)、雞蛋清溶菌酶(14400D))進行SDS-PAGE，然后以相對遷移率對分子質(zhì)量作圖，從圖中求出該β-半乳糖苷酶的分子質(zhì)量。

1.8 β-半乳糖苷酶性質(zhì)研究

1.8.1 溫度和pH值的影響

將反應(yīng)體系分別置于30～85℃的水浴中進行反應(yīng)，測定β-半乳糖苷酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。酶熱穩(wěn)定性的測定是取同樣濃度的β-半乳糖苷酶分別置于40、50、60、70、80℃的水浴中，每隔1h取樣測定殘余酶活力，用保存在4℃冰箱的相同酶液所測得的酶活性作為空白，設(shè)為100%，共測定4h。

純化后的β-半乳糖苷酶在不同pH4.0～10.0條件下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH值。測定pH值穩(wěn)定性是將酶液加入到100mmol/L的不同pH值緩沖液中，再于40℃保溫1h，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定剩余β-半乳糖苷酶的活性。所用緩沖液為：pH4.0～5.5的醋酸鈉緩沖液、pH6.0～7.5的磷酸鈉緩沖液、pH8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液、pH9.0～10.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。以β-半乳糖苷酶在pH6.5時所測的酶活力為100%，其他pH值條件下所測為相對酶活力。

1.8.2 金屬離子的影響

取適當(dāng)稀釋的酶液，向其中分別加入用蒸餾水配制的金屬鹽溶液，40℃保溫1h后，標(biāo)準(zhǔn)方法測定殘余酶活力。金屬鹽分別為：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnSO4、FeCl2、CoCl2、CuSO4、ZnSO4、AgNO3、HgCl2。

1.8.3 酶Km值的測定

在pH6.5、溫度65℃的條件下，分別將ONPG稀釋到終含量0～1%，測定β-半乳糖苷酶在不同底物濃度下的酶活力。根據(jù)Lineweaver-Burk方程，求此條件下的Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-半乳糖苷酶分離與純化

圖1 DEAE-Sepharose FF離子交換層析Fig.1 DEAE-Sepharose fast flow ion exchange chromatographic separation of thermostableβ-galactosidase

采用了硫酸銨分段鹽析、透析、DEAE-Sepharose fast flow離子交換層析、分子篩凝膠過濾層析等純化手段從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24發(fā)酵液中分離純化β-半乳糖苷酶。柱層析純化結(jié)果分別見圖1、2，純化的檢測結(jié)果見圖3。

圖2 Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析Fig.2 Sephadex G-75 gel filtration chromatographic purification of thermostableβ-galactosidase

圖3 β-半乳糖苷酶SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of thermostableβ-galactosidase at different separation and purification steps

硫酸銨分段鹽析顯示，在40%飽和度以下，沉淀蛋白中酶活性較弱，而上清液中檢測到較高的酶活性，在硫酸銨飽和度70%以上時，沉淀β-半乳糖苷酶活性較低。綜合考慮到酶的純化效率和回收率，選擇40%～70%飽和度的硫酸銨鹽析。沉淀后的粗酶蛋白溶解在磷酸緩沖液中，充分透析脫鹽及小分子的雜蛋白和色素。

徹底脫鹽后的粗酶液上樣經(jīng)過充分平衡的離子交換柱，NaCl線性梯度洗脫顯示，分離得到3個較大的蛋白主峰，收集管酶活性檢測到一個酶活性峰，主要在第二個蛋白峰的左側(cè)，所對應(yīng)的NaCl洗脫濃度為0.5mol/L。從洗脫曲線看出，離子交換層析效率較高，能夠去除大部分的雜蛋白，但酶活性峰的對應(yīng)位置沒有明顯清晰的蛋白峰，說明酶液中含有雜蛋白。合并有酶活性的收集管，采用聚乙二醇2 0 0 0 0包埋法濃縮后，上樣Sephadex G-75凝膠柱，進一步純化。凝膠柱層析洗脫曲線顯示3個清晰的蛋白峰，酶活性檢測到第一個蛋白

峰有極強的酶活性，而第二和第三個蛋白峰均沒有酶活性。合并有活性的收集管酶液，進一步電泳檢測以及用于酶的性質(zhì)研究。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明發(fā)酵液中的粗酶液經(jīng)以上純化步驟后，酶純度達(dá)到電泳均一，純化各步驟相應(yīng)的酶活性、蛋白濃度、產(chǎn)率和純化倍數(shù)見表1。

表1 β-半乳糖苷酶的分離純化Table 1 A summary of purification steps of thermostableβ-galactosidase fromB. stearothermophilusXG 24

由表1可知，酶純化了5 4.5倍，比活力達(dá)到32.7U/mg，產(chǎn)率為20.4%。采用一系列層析技術(shù)從不同的微生物發(fā)酵液中分離純化到β-半乳糖苷酶[11,19-20]，而本研究從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶并分離純化到電泳純的酶蛋白。

經(jīng)各步驟純化后的酶液SDS-PAGE電泳后硝酸銀染色結(jié)果如圖3所示。硫酸銨鹽析后的酶液電泳后有較多的雜蛋白存在，經(jīng)過離子交換層析后，雜蛋白明顯減少，最后分子篩凝膠過濾層析后，顯示單一的一條蛋白帶，表明純化后的酶蛋白達(dá)到電泳純，同標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白對照顯示純化到的β-半乳糖苷酶分子質(zhì)量約為64kD。通過Sephadex G-75色譜柱測定酶蛋白分子質(zhì)量為63.5kD。由此推斷，純化到的β-半乳糖苷酶含有一個蛋白亞基，表觀分子質(zhì)量為64kD。與所報道的嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)(50kD)[19]相似，但比來源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(120kD)[13]、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)(530kD)[21]、嗜熱硫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)(240kD)[22]要小許多。故推測從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24中所純化到的β-半乳糖苷酶可能為一種新的β-半乳糖苷酶的同工酶。

2.2 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 β-半乳糖苷酶最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

如圖4所示，在溫度50～75℃的范圍內(nèi)所測β-半乳糖苷酶活力都在60%以上，最適反應(yīng)溫度為65℃。酶的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖5所示，酶在50℃保溫2h酶活力殘留92%，60℃保溫2h殘留在85%，70℃保溫2h殘留65%活力，80℃保溫2h殘留24%活力。熱穩(wěn)定性實驗表明嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶具有強的熱穩(wěn)定性，比來源于嗜酸乳桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)[11]、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)[23]等菌株的β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性要高。同目前的研究報道相比較，從嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24純化到的β-半乳糖苷酶是國內(nèi)外所報道的β-半乳糖苷酶中耐熱性最強的酶之一。酶的耐熱性強在酶工業(yè)化應(yīng)用中具有很多優(yōu)勢，酶在高溫下處理樣品，可以抑制微生物的生長[24]，防止乳制品雜菌污染。而且高溫下水解反應(yīng)速度快，時間短，可以大量地節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率。目前，耐高溫β-半乳糖苷酶在乳制品加工業(yè)中備受關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 溫度對β-半乳糖苷酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on thermostableβ-galactosidase activity

圖5 溫度對β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on thermostableβ-galactosidase stability

2.2.2 β-半乳糖苷酶最適作用pH值及pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對β-半乳糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on thermostableβ-galactosidase activity and stability

表2 金屬離子對β-半乳糖苷酶活性的影響Table 2 Effect of metal ions on thermostableβ-galactosidase activity

純化后的β-半乳糖苷酶在不同pH值的緩沖體系、65℃條件下測定的酶活性，結(jié)果如圖6所示，β-半乳糖苷酶在pH5.5～7.0之間酶活力在85%以上，最適作用pH值為6.5，同所報道的嗜熱球菌β-半乳糖苷酶最適pH值(pH6.0)[11]接近，但比源于棘孢曲霉的β-半乳糖苷酶最適pH值(pH5.4)[13]稍高。β-半乳糖苷酶在一系列不同pH值的緩沖液中40℃條件下處理1h后，再在最適pH值下測定酶活性，結(jié)果表明，在pH4.0～7.5之間保持90%以上的酶活性，而在pH7.5以上，酶活性則急速下降，表明β-半乳糖苷酶在弱酸性環(huán)境下非常穩(wěn)定。鑒于多數(shù)乳制品飲料的pH值也在這一范圍內(nèi)，故該酶的這些生化特性賦予了嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶乳制品加工中有極大的應(yīng)用優(yōu)勢，因此該酶有著潛在的市場應(yīng)用價值。

2.2.3 β-半乳糖苷酶的反應(yīng)動力學(xué)

固定β-半乳糖苷酶的量，以不同濃度ONPG溶液為底物，測定酶反應(yīng)速度。采用Lineweaver-Burk作圖法，求得嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶對ONPG的Km為4.32mmol/L。同所報道的β-半乳糖苷酶相比較，如嗜熱球菌的Km為8.9mmol/L[11]、棲熱菌屬細(xì)菌(Thermus)的Km為5.9mmol/L[9]、嗜冷動性球菌(Planococcus)的Km為9mmol/L[25]，嗜熱脂肪芽孢桿菌XG24 β-半乳糖苷酶同底物ONPG的親和力較強。

2.2.4 金屬離子對β-半乳糖苷酶的影響

在酶反應(yīng)液中分別加入不同的金屬離子使其終濃度為1mmol/L和10mmol/L。表2顯示：Cu2+、Ag+、Hg2+在所檢測范圍內(nèi)幾乎完全抑制酶的活性，Ca2+、Zn2+具有較弱的抑制活性。Na+、K+對酶活性的作用不明顯；Mg2+、Mn2+、Fe2+和Co2+對酶活性均有促進作用，F(xiàn)e2+、Mn2+在低濃度時激活作用更強，而Mg2+、Mn2+在高濃度時激活作用較強。

3 討 論

分離篩選極端環(huán)境下的一些產(chǎn)生極端生化特性酶的微生物菌株一直是研究的熱點。本實驗室從溫泉附近土壤中分離篩選到一株產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的極端耐熱菌株。從菌株發(fā)酵液中分離純化到了電泳均一的β-半乳糖苷酶。純化步驟簡單、操作簡便，大大減少酶的損失，回收率高。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，β-半乳糖苷酶最適作用pH值為6.5，溫度為65℃。同時具有強的熱穩(wěn)定性，是典型的耐熱型β-半乳糖苷酶。這些生化特性賦予了該酶在乳制品加工中有極大的應(yīng)用優(yōu)勢。酶活性長時間保持穩(wěn)定，并具有較好的酶活力，保存相對比較容易，可以應(yīng)用于一般條件下的工業(yè)生產(chǎn)。也可以在溫度較高的環(huán)境下使用，因此，該極耐熱性β-半乳糖苷酶具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

本研究著重對酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，并對其工業(yè)應(yīng)用前景進行了探討和展望。但對該酶耐熱的分子機制研究還處于探索階段。對該酶的分子機制的更進一步研究將有利于后續(xù)更多微生物極端酶的開發(fā)和利用。

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Purification and Enzymatic Characterization of Thermostableβ-Galactosidase from Bacillus stearothermophilus XG24

GAO Zhao-jian，HOU Jin-hui，SUN Hui-gang，DIAO Jin-jin
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The fermentation supernatant of Bacillus stearothermophilus XG24 received salting out with ammonium sulfate, separation on DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange column and purification on Sephadex G-75 gel filtration column to obtain high-purity thermostable β-galactosidase, which was subsequently subjected to enzymatic characterization with o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside (ONPG) as a substrate. After the above separation and purification procedures, the purity of this enzyme showed a 54.5-fold increase, with an activity recovery of 20.4%, and the specific activity of the purified enzyme was 32.7 U/mg protein. The optimal pH and temperature for the reaction of this enzyme were 6.5 and 65 ℃, respectively. It was stable at temperatures below 70 ℃ or in a pH range between 4.0 and 8.0. Its activity was notably promoted by Mg2+, Mn2+, Fe2+and Co2+, whereas Cu2+, Ag+and Hg2+were almost able to entirely inhibit its activity. The Kmtowards ONPG was determined to be 4.32 mmol/L. The SDS-PAGE analysis revealed that this enzyme was a single-chain protein. Based on the results of Sephadex G-75 gel filtration chromatographic measurement, it was deduced that the apparent molecular weight of this enzyme was 64 kD. Therefore, Bacillus stearothermophilus XG24-derived thermostable β-galactosidase has high application potential in the dairy industry.

Bacillus stearothermophilus；β-galactosidase；purification；characterization

Q939.97

A

1002-6630(2010)23-0151-06

2010-03-21

徐州市博士科研啟動基金資助項目

高兆建(1976—)，男，講師，博士，主要從事微生物次生代謝產(chǎn)物與基因工程。E-mail：gaozhaojian@126.com