土壤中正己醇降解菌的多樣性研究

張錦華，師俊玲*

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

土壤中正己醇降解菌的多樣性研究

張錦華，師俊玲*

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

目的：篩選能夠有效降低正己醇含量的微生物菌種，了解自然界中正己醇降解菌的分布與多樣性。方法：以正己醇生產(chǎn)廠廢水排放口周圍的土壤為分離源，通過富集培養(yǎng)和分離篩選。結果：獲得了6株對正己醇有顯著降解作用的菌種，根據(jù)其在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)初步分類鑒定為鐮孢菌屬、地霉屬、毛霉屬和曲霉屬。其中，地霉屬的菌株最多(3株)，對正己醇的降解能力強，適用pH值范圍廣。地霉屬菌株S12和S13在中性和酸性條件下對3g/L正己醇的降解率均達60%以上。結論：自然界中的正己醇降解菌在種類、生態(tài)、降解能力、作用條件等方面都具有豐富的多樣性。

正己醇；多樣性；正己醇降解菌；分離；篩選；分類鑒定

正己醇屬于高級醇，是食品中雜醇油的主要成分之一。雜醇油是一類高沸點的混合物，具有特殊強烈的刺激性臭味，在口味上弊多利少，其含量過多會導致辛辣苦澀，給酒帶來不良影響。其對人體的中毒和麻醉作用強于乙醇，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，引起頭痛；而且在體內的氧化速度比乙醇慢、停留時間長[1-2]，具有一定的生理毒性[3]。此外，正己醇也是引起大豆豆腥味的主要成分之一[4-5]。因此，降低食品中正己醇的含量對于提高產(chǎn)品風味和安全性具有重要意義。

據(jù)報道，在化學催化條件下，正己醇可轉化為正己醛[6-7]或己酸己酯[8-9]?？紤]到化學催化過程中會產(chǎn)生很多的負反應，安全有效的生物轉化方法在食品加工中將更具優(yōu)勢。微生物個體及其產(chǎn)生的豐富酶系是進行生物轉化的重要資源。據(jù)報道，乙醇脫氫酶ADH[10]、固醇氧化酶[11]、聚乙烯醇降解酶[12-13]等能夠對相應醇類進行轉化，這些酶類都可以由微生物產(chǎn)生，有關的降解機理及特性也有廣泛研究。在本實驗的前期研究中，從蘋果園的土壤中分離得到了一株能夠降低正己醇含量的

微生物菌種，經(jīng)鑒定為白地霉[14]，從而證明了自然界中存在能夠降解正己醇的微生物。

為了證明自然界中正己醇降解菌的微生物多樣性，分離篩選正己醇降解能力強的微生物菌種，本實驗以正己醇生產(chǎn)廠廢水排放口周圍的土壤為分離源，從中分離篩選能夠降解正己醇的微生物菌種，對其進行分類鑒定，評價其對正己醇的降解能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤

蘭州正己醇生產(chǎn)廠(蘭州恒澳工貿(mào)有限公司)廢水排放口周圍的表層土壤，直接過60目篩網(wǎng)，將土壤與未通過60目篩的石塊分離，分別用作微生物的分離源。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體富集培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，不同質量濃度梯度正己醇(400、800、1200、1600、2000、2400、2800、3200mg/L)，pH7.0。

液體分離篩選培養(yǎng)基：MgS O4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0g、NH4NO31.0g、6.67g/L CaCl2溶液3mL、17g/L的FeCl3溶液3mL、FeSO4·7H2O 0.05g、NaNO31.0g，蒸餾水1000mL。使用時設定兩組pH值水平，一組為自然pH值(7.0)，另一組用HCl和NaOH調節(jié)pH值至4.6。上述組分滅菌后加入經(jīng)0.22μm無菌濾膜(醋酸纖維膜)過濾除菌的正己醇3mL。其中，正己醇在加入前先用0.5mL吐溫-80溶解，再加入2mL無菌水，充分振蕩混合均勻后過濾除菌。此處，正己醇作為培養(yǎng)基中的唯一碳源。

分離篩選用固體培養(yǎng)基：在上述液體分離篩選培養(yǎng)基中加入20g/L的瓊脂粉。

分類鑒定用培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，其中加入20g/100mL的馬鈴薯浸汁1000mL，葡萄糖20g，瓊脂粉20g。

1.1.3 試劑

正己醇(色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司進口分裝；其他試劑均為分析純

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；ES-315 TOMY高壓蒸汽滅菌鍋 Kogy有限公司；SPX-300B-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；ZHWY-2102 型恒溫培養(yǎng)振蕩器、HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；GC9800氣相色譜儀 上海科創(chuàng)色譜儀器有限公司；丹佛T-203型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Motic BA400型數(shù)碼成像光學顯微鏡上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正己醇降解菌的馴化與富集

參照瓶富集培養(yǎng)技術[15-16]，對過篩后的土壤樣品和石塊分別進行菌種的馴化富集培養(yǎng)，分別取土壤和石塊樣品10g加入到100mL不含正己醇的液體富集培養(yǎng)基的三角瓶中(250mL)，28℃、150r/min搖床培養(yǎng)3d后，取含菌的培養(yǎng)液按體積分數(shù)10%的接種量轉接至100mL含正己醇400mg/L的液體富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，完成一個馴化周期后將菌液轉移到新的富集培養(yǎng)液中進行下一輪馴化富集培養(yǎng)。富集液培養(yǎng)條件為28℃、150r/min，按照400、800、1200、1600、2000、2400、2800、3200mg/L的水平依次提高富集培養(yǎng)液中的正己醇質量濃度，共計培養(yǎng)27d，得到富集降解正己醇菌株的培養(yǎng)物種子。

1.3.2 正己醇降解菌的篩選與分離純化

采用固體平板培養(yǎng)的方法篩選[17]。按分離篩選用固體培養(yǎng)基所示成分制備平板培養(yǎng)基，富集馴化結束后，吸取1mL菌懸液直接涂布接種于表面，在28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待有菌落長出后，選擇不同形態(tài)特征的菌落，重新轉接至固體篩選培養(yǎng)基上進行劃線分離，轉接3次后將初步篩選到的菌株接種至PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)進行進一步的純化直到分離出純菌種。

1.3.3 正己醇降解菌的鑒定

將待鑒定的純化后的菌種用5mm打孔器打孔接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5d后觀察其菌落生長情況和形態(tài)，挑取菌絲和孢子制成玻片，置于光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)以及孢子與營養(yǎng)體之間的著生關系，對照有關文獻確定真菌的分類學地位[18-19]。

1.3.4 正己醇降解菌降解能力的檢驗

[20-21]將分離到的正己醇降解菌在PDA平板上活化培養(yǎng)3d后用打孔器打取直徑為5mm的帶菌培養(yǎng)物，按3塊/30mL的量接種至pH7.0和pH4.6的正己醇基礎培養(yǎng)液中(50mL三角瓶中裝30mL培養(yǎng)液)，水浴恒溫28℃、120r/min搖床培養(yǎng)7d。

培養(yǎng)結束后，取全部培養(yǎng)物于3500r/min離心10min，取上層清液用0.22μm無菌濾膜過濾除菌，收集濾液用頂空進樣法氣相色譜測定正己醇含量(GC9800/ FID檢測器)，以體積分數(shù)5% 4-甲基-2-戊醇(丙酮定容)為內標，進行定量分析，考察正己醇殘留量。對照為經(jīng)過相同培養(yǎng)的含同樣質量濃度正己醇的無菌體培養(yǎng)液。

1.3.5 正己醇殘留量和降解率的測定

對照和樣品中正己醇殘留量用頂空進樣法氣相色譜檢測。檢測條件為：FID檢測器；彈性石英毛細管柱DB-WAX-10(30m×0.32mm，0.25μm)；載氣為N2，進樣量300μL；采取程序升溫(第一階段初始溫度55℃，初溫保持時間3min，升溫速率：15℃/min，終止溫度

200℃，終溫保持時間3min；第二階段，初始溫度0℃，升溫速率0℃/min，終止溫度0℃)。通過內標法(以體積分數(shù)5% 4-甲基-2-戊醇(丙酮定容)為內標)獲得正己醇的保留時間和峰面積。按照下式計算正己醇降解率。

式中：A0為對照樣的正己醇峰面積；A1為正己醇降解菌培養(yǎng)液中正己醇峰面積。

2 結果與分析

2.1 正己醇降解菌的分離篩選

通過富集馴化培養(yǎng)，從土壤和石塊樣品中初步分離得到菌種8株，經(jīng)反復純化、確認，最終獲得6個不同的菌株，其中2株來自土壤，4株來自石塊，且全部為真菌。

2.2 菌種的正己醇降解能力

對照樣和樣品的氣相色譜圖如圖1所示。

圖1 對照樣(A)和樣品(B)的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatography of the control and samples

培養(yǎng)結束后，對分離到的正己醇降解菌進行降解能力的測定，結果見表1。

表 1 所得菌株對正己醇的降解作用Table 1 Degradation of hexanol using isolated strains

表2 所篩選正己醇降解菌的菌落特征和個體特征Table 2 Morphological characteristics of colonies and spores from isolated strains

設定對照中正己醇的降解率為100%，則方差分析和多重比較分析表明，分離得到的6株菌均能顯著降低樣品中正己醇含量(P＜0.05；6株菌與對照間差異均在α=0.05水平上達到顯著水平)，但不同菌株對正己醇的

降解能力和條件各不相同。除菌株S12以外，其他菌株在中性條件下對正己醇的降解率均高于酸性條件；菌株T1、T2、S2在中性條件下對正己醇的降解率可達酸性條件下的3倍以上；菌株S11對正己醇的降解作用最小，在中性和酸性條件的降解率均在30%以下。總體而言，菌株S12和S13對正己醇的降解能力最強，它們在中性和酸性條件下對正己醇的降解率均可達60%以上，是降解正己醇的優(yōu)勢菌株。

2.3 正己醇降解菌的分類鑒定

參考《真菌鑒定手冊》[20]，根據(jù)菌種在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢方式、孢子形態(tài)和大小可知，所得正己醇降解菌分屬于鐮孢霉屬、地霉屬、毛霉屬和曲霉屬。其中，有3株均為地霉屬。各菌株的具體特征及形態(tài)見表2及圖2～7。

圖2 菌株T1在PDA培養(yǎng)基上的菌落(A)與孢子(B)(×40)Fig.2 Colonies and spores of strain T1 on PDA (×40)

圖3 菌株T2在PDA培養(yǎng)基上的菌落(A)與孢子(B)(×40)Fig.3 Colonies and spores of strain T2 on PDA (×40)

圖4 菌株S12在PDA培養(yǎng)基上的菌落(A)及顯微特征(B)(×40)Fig.4 Colonies and microscopic characteristics of strain S12 on PDA (×40)

圖5 菌株S13在PDA培養(yǎng)基上的菌落(A)及顯微特征(B)(×40)Fig.5 Colonies and microscopic morphology of strain S13 on PDA (×40)

圖6 菌株S11在PDA培養(yǎng)基上的菌落(A)與孢子(B)(×40)Fig.6 Colonies and spores of strain S11 on PDA (×40)

圖7 菌株S2在PDA培養(yǎng)基上的菌落(A)及孢子(B)(×40)Fig.7 Colonies and spores of strain S2 on PDA (×40)

3 討論與結論

綜合菌種的分類鑒定結果及其對正己醇的降解能力可以發(fā)現(xiàn)，自然界中的正己醇降解菌在種類、生態(tài)、降解能力、作用條件等方面都具有豐富的多樣性。

3.1 自然界中正己醇降解菌的種類多樣性

本研究在繼令楨民等[14]之后，再次證明了自然界中存在能夠降解正己醇的微生物，而且其在種類上具有一定的多樣性。與其不同的是，本研究除了發(fā)現(xiàn)3株地霉屬有正己醇降解能力以外，還發(fā)現(xiàn)鐮孢菌屬、毛霉屬、曲霉屬的一些菌株也能夠在一定條件下降解正己醇；與其相同的是，本研究也未發(fā)現(xiàn)能夠降解正己醇的細菌和放線菌。

3.2 正己醇降解菌的生態(tài)多樣性

本實驗在土壤和石塊表面都分離得到了能夠降解正己醇的真菌，其中來自土壤的有2株，分別為鐮孢菌屬和地霉屬；來自石塊的有4株，分別為毛霉屬、曲霉屬和地霉屬。這可能跟菌種的生長特性，及其與土壤顆粒和石塊的黏附性能有關。此外，本次采集的土壤主要來自于正己醇富集量較大的正己醇生產(chǎn)廠的廢水排放口，令楨民等[14]所用土壤則來自于蘋果園。這說明，自然界中的正己醇降解菌在生態(tài)分布上具有一定多樣性。

3.3 真菌降解正己醇能力的多樣性

研究發(fā)現(xiàn)，不同菌種和菌株在相同條件下對正己醇的降解能力存在較大差異。綜合分析，毛霉屬的正己醇降解能力最弱，在中性和酸性條件下的正己醇降解率均在30%以下；地霉屬的正己醇降解能力較強。中性條件下，地霉屬菌株S13對正己醇的降解率可達77%，

而毛霉屬菌株S11的降解率僅為23%；即使同為地霉屬，菌株S 1 2在酸性條件下對正己醇的降解率可達71%，而菌株T2則只有18%。

3.4 正己醇降解菌降解條件的多樣性

本實驗發(fā)現(xiàn)，不同菌種降解正己醇時所需條件和同一菌株在不同條件下對正己醇的降解能力間存在很大差異。中性條件下對正己醇降解能力最強的是菌株S13，酸性條件下對正己醇降解能力最強的是菌株S12；大多數(shù)菌株在中性條件下的正己醇降解能力均大于酸性條件，除地霉屬的兩株菌株S12和S13以外，其他的鐮孢菌屬、毛霉屬、曲霉屬和地霉屬菌株T2在酸性條件下的正己醇降解率約為中性條件下的1/3左右。地霉屬菌株S12和S13的正己醇降解率在中性和酸性條件下無顯著變化，菌株S12在酸性條件下的正己醇降解率反而稍高于中性條件。這說明，不同菌株對正己醇的降解條件存在很大差異，表現(xiàn)出豐富的多樣性。

參考文獻：

[1]周新虎, 崔如生. 引起白酒口干、上頭問題的初探[J]. 釀酒科技, 2001(5)∶ 44-45.

[2]張躍廷, 劉瓊, 王佐民. 淺談雜醇油[J]. 釀酒, 2002, 29(5)∶ 18-20.

[3]GAUKE V, CATHERINE W, HANS S, et al. Human health risk assessment of long chain alcohols[J]. Ecotox Environ Safe, 2009, 72(4)∶1016-1030.

[4]謝繼志, 肖麗霞, 夏玉雷, 等. 脫腥方法對豆?jié){中正己醛和正己醇含量的影響[J]. 江蘇農(nóng)學院學報, 1996, 17(1)∶ 155-173.

[5]MOREIRA M A, TAVARES S R, RAMOS V, et al. Hexanal production and TBA number are reduced in soybean [Glycine max (L.) Merril] seeds lacking lipoxygenase isozymes 2 and 3[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993, 41(1)∶ 103-106.

[6]周廣棟, 郭曉紅, 劉延, 等. 正己醇氧化生成正己醛磷鎢雜多酸催化劑的過氧化氫分解活性[J]. 分子催化, 2001, 15(4)∶ 267-272.

[7]王磊, 程鐵欣, 周廣棟. 正己醇(氧化)脫氫制正己醛的研究[J]. 分子催化, 2003, 17(6)∶ 434-438.

[8]何建英, 劉素環(huán), 陳丹紅. 己酸己酯的催化合成[J]. 化工中間體, 2007 (4)∶ 7-8.

[9]YANG W, BILLY J, TAAIT Y B, et al. H3PW12O40 supported on Cs modified mesoporous silica∶ catalytic activity in n-butane isomerisation and in situ FTIR study∶ Comparison with microporous CsxH3-xPW12O40 [J]. Catalysis Today, 2002, 73(1/2)∶ 153-165.

[10]曾芳芳, 劉盛元, 王濱有. 乙醇脫氫酶基因多態(tài)性與飲酒行為及所致相關疾病的研究進展[J]. 疾病控制雜志, 2008, 12(2)∶ 164-167.

[11]張國華, 叢愛日, 徐國賓, 等. 3α-羥類固醇脫氫酶的表達、純化和酶學性質研究[J].微生物學報, 2004, 44(4)∶ 496-499.

[12]SUZUKI T, ICHIHARA Y, YAMADA M. Some characteristics of Pseudomonas O-3 which utilizes polyvinyl alcohol[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1973, 37(4)∶ 747-756.

[13]TOKIWA Y, KAWABATE G, JARERAT A. A modified method for isolating (polyvinyl alcohol) degrading bacteria and study of their degradation patterns[J]. Biotechnoogy Letters, 2001, 23∶ 1937-1941.

[14]令楨民, 師俊玲, 楊保偉. 正己醇降解菌的分離、篩選及分類鑒定[J]. 菌物學報, 2009, 28(6)∶ 769-775.

[15]黃星, 何健, 潘繼杰, 等. 甲磺隆降解菌FLDA的分離鑒定及其降解特性研究[J]. 土壤學報, 2006, 43(5)∶ 821-827.

[16]王學東, 歐曉明, 王慧利, 等. 除草劑咪唑煙酸高效降解菌的篩選及其降解性能的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2006, 22(1)∶ 102-105.

[17]楊文博. 微生物學實驗[M]. 北京∶ 化學工業(yè)出版社, 2004∶ 44-48.

[18]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上?！?科學技術出版社, 1979∶ 1-780.

[19]巴尼特 H L, 亨特B B. 半知菌屬圖解[M]. 北京∶ 科學出版社, 1977∶1-240.

[20]王春艷, 丁永生. 石油降解菌的篩選及其降解特性[J]. 大連海事大學學報, 2008, 34(3)∶ 9-12.

[21]李愛華, 樊明濤, 師俊玲. 杜仲內生菌的分離及產(chǎn)PDG菌株的篩選[J]. 西北植物學報, 2007, 27(3)∶ 616-619.

Diversity of Hexanol-degrading Strains in Soil

ZHANG Jin-hua，SHI Jun-ling*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Hexanol is an unfavorable flavor in food. Too much hexanol in food is harmful for human health. Screening and understanding diversity of hexanol-degrading microorganisms are helpful for biological degradation of hexanol and its potential application in food industry, which will provide basic information for further research on hexanol-degrading mechanisms. Soil around wastewater outfalls of hexanol-producing plants was used as the resources to screen hexanoldegrading microorganisms. After enrichment and isolation, 6 strains with degradation capability for hexanol were obtained. Based on morphological characteristics of colonies and spores, 6 strains were classified as fungi, which belonged to Fusarium Link, Geotrichum Link, Mucor Link and Aspergillus P. Micheliex Link, respectively. Geotrichum Link had 3 isolated strains, which exhibited higher hexanol-degrading capacity and wider suitability of pH. The strains in Geotrichum Link, S12 and S13 could result in the degradation of 3 g/L hexanol up to 60% under both neutral and acidic conditions. The rich diversity of hexanol-degrading strains in soil was reflected in species, ecology, degradation capacity, conditions and other aspects.

hexanol；diversity；hexanol-degrading strains；isolation；screening；identification

Q939.5

A

1002-6630(2010)09-0177-05

2009-08-17

國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術體系項目(nycytx-30-ch-03)；西北農(nóng)林科技大學科技創(chuàng)新專項(cx200905)

張錦華(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：orange04zhang@yahoo.com.cn

*通信作者：師俊玲(1972—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：sjlshi2004@yahoo.com.cn