高速逆流色譜法分離純化紅曲色素組分

鄭允權(quán)，李泳寧，王阿萬，陳芬玲，石賢愛，郭養(yǎng)浩,,*

(1.福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福建 福州 350002；2.福建省醫(yī)療器械與醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

高速逆流色譜法分離純化紅曲色素組分

鄭允權(quán)1，李泳寧1，王阿萬2，陳芬玲2，石賢愛2，郭養(yǎng)浩1,2,*

(1.福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福建 福州 350002；2.福建省醫(yī)療器械與醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

采用高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化紅曲發(fā)酵產(chǎn)品中6種Azaphilone類色素組分。篩選弱極性分離溶劑系統(tǒng)正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水，研究6種色素組分在不同溶劑體系中的分配系數(shù)，建立兩步逆流萃取分離的技術(shù)路線。經(jīng)過HPCCC分離純化和丙酮結(jié)晶操作，得到6種高純度的Azaphilone類色素組分，純度均大于98.5%，得率達(dá)到81.40%～84.78%，所得的6種色素組分的摩爾吸光系數(shù)分別為13313、13877、9380、9360、25621、25849 L/(mol·cm)。本研究可提供一種新型的制備高純度紅曲Azaphilone類色素組分的技術(shù)路線。

紅曲色素；高速逆流色譜；分離純化

紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)與應(yīng)用在我國已有一千多年歷史，主要用于食品著色、釀酒和傳統(tǒng)中藥材。目前國內(nèi)外對紅曲色素產(chǎn)品的需求增長很快。

紅曲霉菌生長過程中產(chǎn)生大量的Azaphilone類代謝產(chǎn)物，其由聚酮合成酶(polyketide synthases，PKS)代謝途徑合成[1-2]。紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)品中含有十多種Azaphilone類化合物，其中最主要的是6種色素組分，2種紅色素(rubropunctatamine、monascorubramine)、2種黃色素(mo n a sc i n、a n k a f l a v i n)和2種橙色素(rubropunctatin、monascorubrin)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明Azaphilone類化合物對鞘氨醇激酶、脂肪酸合成酶、端粒酶、gp120-CD4、Grb2-SH2和p53-MDM2等，以及3大疾病(癌癥、艾滋病和心血管疾病)相關(guān)的關(guān)鍵酶蛋白具有重要的生物活性作用[3-4]。不同紅曲色素組分的生物活性，如黃色素的治療代謝綜合癥[5]和抑癌[6-8]作用已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。

目前紅曲色素商品主要為混合物，色價(jià)和色調(diào)都不穩(wěn)定。若能分離純化單一結(jié)構(gòu)的紅曲色素產(chǎn)品，將有利于開拓色素組分的應(yīng)用范圍。高純度紅曲Azaphilone組分及其衍生物的制備有利于新型藥物研發(fā)和制藥產(chǎn)業(yè)鏈的延伸。

圖1中6種色素組分在化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上十分相似，分離純化較為困難。目前市場上未見高純度的紅曲色素產(chǎn)品，也未見單一組分的紅曲色素化合物標(biāo)準(zhǔn)品。張慧娟等[9]采用二次薄層層析法分離純化紅斑紅曲素，鐘立人等[10]采用高效液相色譜研究紅曲色素組分的分離，這些方法僅能純化得到毫克級紅曲色素。連喜軍等[11]采用樹脂法分離紅曲黃色素和紅色素，但各種樹脂對紅曲色素的吸附量均低于52U/g。代春華等[12]采用硅膠柱層析法分離紅曲黃色素，處理量小且較難實(shí)現(xiàn)單一組分紅曲色素的分離純化。夏明等[13]采用高速逆流色譜分離得到一種黃色素與一種紫紅色素，但未能對分離得到的色素組成、純度和得率做進(jìn)一步分析。

高速逆流色譜技術(shù)無需固相載體支持，避免了因發(fā)生不可逆吸附而引起的樣品損失、變性等問題，分離用有機(jī)溶劑易回收使用且節(jié)省了分離材料消耗，已廣泛應(yīng)用于各種天然產(chǎn)物及抗生素的分離制備。高速逆流萃取色譜法制備高純度6種紅曲色素的研究在國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取-高速逆流色譜法分離-結(jié)晶的組合技術(shù)分離純化6種紅曲色素組分，以期確立有效的單組分紅曲色素的規(guī)?；苽浼夹g(shù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

乙腈(色譜純)；其他試劑均為分析純。

液相色譜系統(tǒng)(含1525二元泵、2996二極管陣列檢測器) 美國Waters公司；TBE300B高速逆流萃取色譜上海同田生物技術(shù)有限公司；Eyela N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本Eyela公司；1100 LC/MS Trap XCT液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.2方法

1.2.1紅曲色素測定

6種紅曲色素采用HPLC-DAD-MS進(jìn)行分析測定和結(jié)構(gòu)鑒定，測定條件參照文獻(xiàn)[14]。色價(jià)測定方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4926—2008《食品添加劑：紅曲米(粉)》)。

1.2.2高速逆流色譜法分離紅曲色素條件

溶劑體系A(chǔ)為正已烷-醋酸乙酯-甲醇-水(10:0:7.5: 2.5，V/V)，溶劑體系B為正已烷-醋酸乙酯-甲醇-水(2.5:7.5:5:5，V/V)，取上層液為固定相，下層液作為流動相。循環(huán)水浴溫度：25℃；螺旋管柱轉(zhuǎn)速：900r/min (正轉(zhuǎn))；分離樣品流速：3.0 m L/m i n；檢測波長：254nm。

2　結(jié)果與分析

2.1紅曲色素的提取

紅曲樣品由本研究所固酵發(fā)酵方法制備(色價(jià)6030U/g)。稱取10g樣品采用70%乙醇溶液(固液比1:10)超聲波萃取兩遍，合并萃取液，真空濃縮至原體積1/2即析出色素粗提物，總色價(jià)為59413U，得率大于98.5%。

2.2高速逆流色譜法分離純化不同的色素組分

紅曲色素難溶于水。故選取多種中等極性溶劑系統(tǒng)和弱極性溶劑系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)最有利于色素組分的分離。

采用均勻設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法，對正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)中不同組分配比進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。紅曲色素主要成分為6種化合物(圖1)，2種紅色素(R1：rubropunctatamine；R2：monascorubramine)、2種黃色素(Y1：monascin；Y2：ankaflavin)和2種橙色素(O1：rubropunctatin；O2：monascorubrin)。應(yīng)用HPLC法[15]測定不同溶劑體系中不同色素組分的分配系數(shù)K值，結(jié)果如表1所示。在溶劑體系4中，紅曲色素Y1、Y2、O1和O2的分配系數(shù)相比差異最大，但KR1和KR2相差較小，可以實(shí)現(xiàn)紅色素組分(R1和R2)與Y1、Y2、O1和O2的分離；在溶劑體系7中，紅曲色素R1和R2分配系數(shù)比為3.19，可實(shí)現(xiàn)R1和R2的分離。紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)品中6種色素組分共存，采用單種溶劑體系無法實(shí)現(xiàn)6種色素組分的完全分離?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，制定了6種色素組分的兩步分離策略，首先采用溶劑體系4實(shí)現(xiàn)紅色素組分(R1和R2)與Y1、O1、Y2和O2的分離，繼而通過溶劑體系7實(shí)現(xiàn)R1與R2的分離。

表1　紅曲色素的分配系數(shù)Table1　Partition coefficients of Monascus pigments

如圖2A所示，采用溶劑體系4(正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水，10:0:7.5:2.5，V/V)分離得到5個(gè)峰分別為紅色素組分(R1和R2)、Y1、O1、Y2和O2。收集紅色素組分采用溶劑體系7(正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水，2.5: 7.5:5:5，V/V)進(jìn)一步分離R1和R2，如圖2B所示。收集各個(gè)分離組分樣品，真空回收溶劑后即得到各純化組分粉末，純度均大于90%。

圖2　紅曲色素HSCCC譜圖Fig.2　HSCCC chromatograms of Monascus pigments obtained with different solvent systems

2.3色素組分的結(jié)晶純化

采用丙酮溶液進(jìn)行結(jié)晶后分別得到兩種黃色片狀晶體(Y1和Y2)、2種橙色針狀晶體(O1和O2)和2種紫色長方體狀晶體(R1和R2)。如表2所示，經(jīng)過兩步驟分離純化，分別得到6種色素晶體(R1、R2、Y1、Y2、O1和 O2)324.2、73.0、244.9、101.6、149.7、138.9mg，收率81.40%～84.78%。

表2　不同分離步驟紅曲色素的收率Table2　Monascus pigment yields at different separation steps

2.4最終樣品純度檢驗(yàn)和鑒定

圖3　6種紅曲色素樣品的純化和鑒定圖譜Fig.3　HPLC profiles, UV-visible absorption spectra and MS spectra of Monascus pigments

本工作采用HPLC面積歸一化法進(jìn)行6種紅曲色素晶體的純度檢測。如圖3A所示，測得6種樣品的純度均大于98.5%。可以作為測定紅曲色素的標(biāo)準(zhǔn)對照樣，并且可用于紅曲Azaphilone類化合物的藥效研究和藥物開發(fā)。

如圖3B中6種紅曲色素光譜圖所示，根據(jù)特征吸收峰的一致性可以分成3組，R1和R2：304、413、524nm；Y1和Y2：231、291、387nm；O1和O2：213、 247、286、467nm。由HPLC-MS測得6種紅曲色素標(biāo)準(zhǔn)品的一級MS譜圖(圖3C)，可確定R1、R2、Y1、Y2、O1和O2的相對分子質(zhì)量分別為353、381、358、386、354和382。根據(jù)Teng等[16]的研究結(jié)果表明，由光譜圖的一致性和相對分子質(zhì)量確定R1、R2、Y1、Y2、O1和O2分別為rubropunctatamine、monascorubramine、monascin、ankaflavin、rubropunctatin和monascorubrin。

本工作所制備的6種紅曲色素的摩爾吸光系數(shù)分別為13313、13877、9380、9360、25621、25849L/(mol·cm)，其對應(yīng)色價(jià)分別為37714、36424、26200、24248、72375、67667U/g。目前市場上的紅曲色素商品(黃色素或紅色素)的色價(jià)為10000～15000U/g，本工作所制備色素產(chǎn)品的純度顯著高于市售相關(guān)產(chǎn)品。

3　結(jié) 論

本工作采用乙醇溶液萃取-高速逆流萃取色譜法分離-結(jié)晶組合技術(shù)，從紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)品中分離純化得到兩種紅色素(rubropunctatamine、monascorubramine)、兩種黃色素(monascin、ankaflavin)和兩種橙色素(rubropunctatin、monascorubrin)晶體，純度均大于98.5%。本方法操作步驟簡單，且6種色素收率均大于81%。本研究提供了一種新型的制備高純度紅曲Azaphilone類色素組分的技術(shù)路線，可為紅曲Azaphilone類化合物的藥效研究和藥物開發(fā)提供參考。

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Separation and Purification of Monascus Pigments by High-speed Counter-current Chromatography

ZHENG Yun-quan1，LI Yong-ning1，WANG A-wan2，CHEN Fen-ling2，SHI Xian-ai2，GUO Yang-hao1,2,*
(1. Institute of Pharmaceutical Biotechnology and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002, China；2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China)

Six azaphilone-type pigments were separated from Monascus-fermented solid medium and purified/fractionated by by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). A solvent system with weak polarity involving four components nhexane, ethyl acetate, methanol and water was selected and used for HSCCC. Based on a comparative analysis of partition coefficients of target compounds in different solvent systems, a two-step HSCCC routine was developed. After separation by HSCCC and crystallization with acetone, six azaphilone-type pigments with high purity were obtained. The purity of each pigment was above 98.5% and their yields were between 81.40% and 84.78%. Their molar absorption coefficients were 13313, 13877, 9380, 9360, 25621 L/(mol·cm) and 25849 L/(mol·cm), separately.

Monascus pigments；high-speed counter-current chromatography；separation and purification

TS202；Q819

A

1002-6630(2010)20-0192-04

2010-05-20

福建省醫(yī)療器械與醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2009年開放基金項(xiàng)目(09002)

鄭允權(quán)(1981—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：yunquanzheng@yahoo.com.cn

*通信作者：郭養(yǎng)浩(1950—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)樯镏扑?。E-mail：yanghaoguo@yahoo.com.cn