酶改性對(duì)高溫變性豆粕溶解性的影響

任為聰，程建軍,*，張智宇，趙偉華，江連洲,2

酶改性對(duì)高溫變性豆粕溶解性的影響

任為聰1，程建軍1,*，張智宇1，趙偉華1，江連洲1,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用堿性蛋白酶改性提高高溫變性豆粕的溶解性。以氮溶解指數(shù)(NSI)為指標(biāo)，考察pH值、底物質(zhì)量濃度、加酶量、溫度、時(shí)間對(duì)高溫變性豆粕NSI的影響。通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定優(yōu)化酶解高溫變性豆粕的工藝條件，在pH9.0、底物質(zhì)量濃度8.56g/100mL、加酶量13004.69U/g pro、溫度59.10℃、時(shí)間20.47min時(shí)，水解度(DH)雖然為15.86%，但NSI值從21.24%達(dá)到了92.58%。

酶法改性；高溫變性豆粕；響應(yīng)面；NSI

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，尤其具有較好的功能特性[1]，其中一些重要的功能特性依賴于蛋白質(zhì)的溶解性才能得以體現(xiàn)，因此，蛋白質(zhì)的溶解性在一定程度上決定了蛋白質(zhì)的功能特性[2]。高溫變性豆粕是大豆煉油后的副產(chǎn)物，煉油工藝中高溫脫溶步驟造成蛋白質(zhì)的熱變性，導(dǎo)致了高溫變性豆粕的蛋白質(zhì)溶解性較差。為了提高蛋白質(zhì)的溶解性，可以進(jìn)行物理、化學(xué)和生物酶法等的處理[3]。其中生物酶方法較為溫和，酶所特有的專一性能夠斷裂肽鏈，使原本暴露在蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)外部的疏水性氨基酸殘基被斷裂，使得蛋白質(zhì)溶解性提高[4]。Sara等[5]和Lee等[6]利用單酶或復(fù)合酶對(duì)大豆分離蛋白改性后水解物與天然態(tài)相比，其溶解度大大提高。Walsh等[7]對(duì)大豆分離蛋白先用Alcalase限制性水解，再用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶交聯(lián)化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近具有較高溶解性，經(jīng)這種方法處理大豆蛋白在低酸性食品和飲料中有很大用途。隨著控制性酶解技術(shù)的成熟，大量研究者投身其中，Tsumura等[8]控制性水解大豆分離蛋白的β半球蛋白和球蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β半球蛋白水解液凍干粉在pH 7.0和8.0時(shí)的溶解性高于大豆分離蛋白的溶解性。Lamsal等[9]認(rèn)為限制性水解使得可電離氨基酸和羧基基團(tuán)大量暴露，致使限制性水解后的蛋白溶解性明顯高于未水解對(duì)照樣。近些年，隨著響應(yīng)曲面試驗(yàn)方法在酶解中的應(yīng)用，許多國(guó)外研究者利用此方法對(duì)水解過(guò)程中蛋白質(zhì)溶解性、氨基氮等進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)[10-14]，使得對(duì)酶解工藝的優(yōu)化更加方便。

1 材料與方法

1.1 材料

高溫變性豆粕 黑龍江省雙鴨山市楊霖油脂廠。

1.2 試劑與儀器

Alaclase蛋白酶(酶活力198638.3U/mL) 丹麥Novo

公司；3,5-二硝基水楊酸(DNS)為化學(xué)純；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HYP-2型消化爐 上海纖檢儀器有限公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；THZ-82型恒溫水浴振蕩器 金壇市億通電子儀器有限公司；電動(dòng)攪拌槳 金壇市中大儀器廠；飛鴿TDL-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；TDW馬弗爐 溫州市雙嶼儀器廠。

1.3 測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；粗脂肪測(cè)定：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》；灰分測(cè)定：GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》；水分測(cè)定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；粗纖維測(cè)定：GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》；總糖含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]；酶活力測(cè)定：按照福林-酚法(SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》)；水解度測(cè)定：pH-stat方法，參照文獻(xiàn)[16]。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備

高溫豆粕粉碎過(guò)80目篩，備用。

1.4.2 堿性蛋白酶改性過(guò)程

過(guò)80目篩樣品→加水調(diào)節(jié)適當(dāng)濃度→調(diào)節(jié)適當(dāng)pH值→加堿性蛋白酶→用2mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值進(jìn)行水解→酶解液→沸水浴滅酶活→離心分離→測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量和水解度(DH)值

1.4.3 酶解工藝及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

表1 試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in response surface design

以不同的pH值、底物質(zhì)量濃度、加酶量、溫度和時(shí)間進(jìn)行各單因素試驗(yàn)。為得到高溶解性的高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)，得堿性蛋白酶酶解的最佳工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以pH(x1)、底物質(zhì)量濃度(x2)、加酶量(x3)、溫度(x4)和時(shí)間(x5)5個(gè)因素為自變量，NSI為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)5因素5水平(1/2實(shí)施)的二次回歸方程，擬合因素和指標(biāo)(響應(yīng)值Y)之間的函數(shù)關(guān)系，用響應(yīng)面分析法尋求酶解最優(yōu)工藝參數(shù)。其試驗(yàn)因素水平選取見(jiàn)表1，方案與結(jié)果見(jiàn)表3，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)均做3個(gè)平行樣，取其平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Design-Expert 7.1軟件(Stat Ease, Inc, Minneapolis，USA)；SPSS13.0；Microsoft Excel 2003處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫變性豆粕部分指標(biāo)測(cè)定

由表2可知，高溫變性豆粕的蛋白質(zhì)含量(干基)可達(dá)到49%左右，蛋白質(zhì)資源豐富，但其可溶性蛋白質(zhì)含量?jī)H占蛋白質(zhì)總量的21%左右，由于熱變性的原因，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，肽鏈松散，大部分疏水基團(tuán)大量暴露在蛋白質(zhì)肽鏈外部，這是導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性下降的根本原因[2]。

2.2 酶改性單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH值對(duì)NSI和DH的影響

圖1 pH值對(duì)NSI和DH的影響Fig.1 Effect of pH on solubility and DH of high-temperature denatured soybean meal

配制底物質(zhì)量濃度5g/100mL的溶液，添加酶2000U/g pro，55℃，反應(yīng)5min條件下，調(diào)節(jié)不同的pH值。結(jié)果如圖1所示，隨著pH值增加到8.5，溶液的NSI值急劇上

升到77.51%，隨后趨于平緩。DH值隨pH值的增加，從2.37%急劇上升到4.06%。在pH8.5酶解時(shí)不溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被改變，造成蛋白質(zhì)不溶解的疏水性基團(tuán)被破壞，斷裂成長(zhǎng)肽鏈，使溶解性提高[4]。升高pH值對(duì)于酶繼續(xù)斷裂已溶解的肽鏈進(jìn)行水解是有利的，但對(duì)提高NSI值效果不顯著，過(guò)高的pH值使蛋白質(zhì)形成有毒聚合物[17]。

表2 高溫變性豆粕主要成分指標(biāo)分析結(jié)果Table 2 General chemical composition of high-temperature denatured soybean meal

2.2.2 底物質(zhì)量濃度對(duì)NSI和DH的影響

圖2 底物質(zhì)量濃度對(duì)NSI和DH的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，添加酶2000U/g pro，55℃，反應(yīng)5min條件下，調(diào)節(jié)不同的底物質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖2。底物質(zhì)量濃度增加到9g/100mL，NSI值緩慢下降到77.72%，隨后急劇下降，在此過(guò)程中，DH值先升高再下降，在底物質(zhì)量濃度為7g/100mL時(shí)，達(dá)到2.92%。過(guò)高底物質(zhì)量濃度使得酶不易與底物相互作用，造成NSI和DH的下降。

2.2.3 加酶量對(duì)NSI和DH的影響

圖3 加酶量對(duì)NSI和DH的影響Fig.3 Effect of enzyme loading on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，底物質(zhì)量濃度9g/100mL，55℃，反應(yīng)5min條件下，調(diào)節(jié)不同的加酶量，結(jié)果如圖3。隨著加酶量的增加，NSI和DH值均急劇升高，達(dá)到12000U/g pro后，酶解不溶性蛋白質(zhì)生成可溶性肽鏈相對(duì)穩(wěn)定，NSI值變化不顯著。繼續(xù)增加加酶量，適合繼續(xù)酶解已溶解的長(zhǎng)肽鏈，使斷裂成更短的小肽鏈，DH值繼續(xù)升高，但對(duì)NSI值變化影響不大。

2.2.4 溫度對(duì)NSI和DH的影響

圖4 溫度對(duì)NSI和DH的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，底物質(zhì)量濃度9g/100mL，加酶量12000U/g pro，反應(yīng)5min條件下，調(diào)節(jié)不同的反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖4。隨著溫度的升高到達(dá)60℃，NSI和DH值均上升，分別達(dá)到83.43%和8.48%，隨后開(kāi)始下降。由于酶對(duì)溫度十分敏感，過(guò)低的溫度均使酶達(dá)不到最佳酶活，過(guò)高的溫度使酶結(jié)構(gòu)開(kāi)始發(fā)生變化，酶活性降低。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)NSI和DH的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)NSI和DH的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on solubility and DH of hightemperature denatured soybean meal

在pH8.5，底物質(zhì)量濃度9g/100mL，加酶量12000U/g pro，在60℃條件下，調(diào)節(jié)不同的反應(yīng)時(shí)間，結(jié)果如圖5。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，NSI和DH值均上升，當(dāng)達(dá)到20min后，NSI值變化不顯著，DH值繼續(xù)上升。由于酶解20min后不溶性蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域基本被破壞，蛋白質(zhì)基本以大肽鏈形式存在于溶液中，使得NSI值趨于穩(wěn)定，但酶仍在繼續(xù)酶解這些大肽鏈，得其變成小肽，因此，DH值仍繼續(xù)上升。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)Design-Expert 7.1進(jìn)行二次回歸分析，根據(jù)方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果，將差異不顯著的因素剔除后得到的回歸方程為：

通過(guò)進(jìn)行方差分析驗(yàn)證模型及各參數(shù)的顯著性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

2.4 模型分析

模型中的參數(shù)x1、x2、x3、x4、x5、x1x4、x3x5、x1、x2、x3、x4、x5都是顯著的(P＜0.05)。模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率[18]。模型失擬項(xiàng)P為0.0678＞0.05，因此，模型失擬項(xiàng)不顯著。模型決定系數(shù)R2為0.9363，擬合度較好。經(jīng)過(guò)回歸分析得出因素x1(pH)和x4(溫度)、x3(加酶量)和x5(時(shí)間)對(duì)考察指標(biāo)NSI交互作用顯著。

2.5 最適條件的模型驗(yàn)證

綜合考慮各項(xiàng)試驗(yàn)因素及其相互作用，根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design-Expert 7.1設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化出酶法改性高溫變性豆粕溶解性的最適工藝條件為：pH9.0、底物質(zhì)量濃度8.56g/100mL、加酶量13004.69U/g pro、溫度59.10℃、時(shí)間20.47min。此條件下的NSI值為92.58%，與模型預(yù)測(cè)值93.01%的相對(duì)誤差為0.46%，差異不顯著，這表明模型是合理有效的，此時(shí)DH值為15.86%。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis for the developed prediction model for NSI

3 結(jié) 論

通過(guò)各單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高溫變性豆粕溶液在酶解過(guò)程中，NSI和DH值增長(zhǎng)趨勢(shì)并不完全相同。

通過(guò)響應(yīng)面分析得到了酶改性條件與高溫變性豆粕NSI值的回歸模型為：Y= －505.65563+ 87.42417x1－ 0.36437x2+5.74312×10-3x3+4.93313x4+2.27067x5－ 0.28675x1x4－1.02937×10-4x3x5－3.95000x12－1.22500× 10-7x23－0.019700x24－0.021250x25，并優(yōu)化出最佳工藝條件為：pH9.0、底物質(zhì)量濃度8.56g/100mL、加酶量13004.69U/g pro、溫度59.10℃、時(shí)間20.47min，在此條件下DH值為15.86%，NSI值為92.58%。

通過(guò)回歸分析得出因素x1(pH)和x4(溫度)、x3(加酶量)和x5(時(shí)間)對(duì)考察指標(biāo)NSI交互作用顯著。

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Effect of Enzymatic Modification on Solubility of High-temperature Denatured Soybean Meal

REN Wei-cong1，CHENG Jian-jun1,*，ZHANG Zhi-yu1，ZHAO Wei-hua1，JIANG Lian-zhou1,2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Soybean Engineering and Technique Research Center, Harbin 150030, China)

The effect of alkaline portease modification on the nitrogen solubility index (NSI) of high-temperature denatured soybean meal was investigated. The optimal conditions for the enzymatic hydrolysis of high-temperature denatured soybean meal were explored by single factor method and response surface analysis. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were found to be: substrate concentration, 8.56 g/100mL; enzyme loading, 13004.69 U/g pro; hydrolysis pH 9.0, hydrolysis temperature, 59.10 ℃; and hydrolysis time, 20.47 min. The degree of hydrolysis (DH) was 15.86% under the optimal hydrolysis conditions, and the NSI was 92.58%, much higher than that before the hydrolysis of 21.24%.

enzymatic modification；high-temperature denatured soybean meal； response surface analysis；NSI

TS214.2

A

1002-6630(2010)21-0137-05

2010-08-08

黑龍江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(GB08B401-02)

任為聰(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與儲(chǔ)藏。E-mail：dacong851120@163.com

*通信作者：程建軍(1969—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锏鞍着c多糖的綜合利用。E-mail：cheng577@163.com