疏水網(wǎng)格濾膜技術檢測食源性致病菌的研究進展

蘇晨曦 ,潘迎捷 ,趙 勇 , Vivian C . H . W u ,孫曉紅＊

( 1 .上海海洋大學食品學院,上海 201306 ; 2 .美國緬因大學食品科學與人類營養(yǎng)系,美國 04469 -5735 )

疏水網(wǎng)格濾膜技術檢測食源性致病菌的研究進展

蘇晨曦1,潘迎捷1,趙 勇1, Vivian C . H . W u2,孫曉紅1＊

( 1 .上海海洋大學食品學院,上海 201306 ; 2 .美國緬因大學食品科學與人類營養(yǎng)系,美國 04469 -5735 )

疏水網(wǎng)格濾膜技術利用膜的疏水性黏附細菌細胞,通過膜的過濾作用截留細菌細胞,然后將膜進行選擇性培養(yǎng),達到檢測鑒定待測菌的目的。主要概述了疏水網(wǎng)格濾膜技術的原理和特點,以及該技術與分子生物學技術、免疫學技術偶聯(lián)在食源性致病菌檢測中的應用。

疏水網(wǎng)格濾膜;微生物學檢測;酶標抗體;DNA探針;菌落雜交

食品中存在的致病性微生物是食物中毒的主要原因之一。據(jù)報道,1992～2001年全國食物中毒事件中,微生物引起的食源性疾病事件和涉及人數(shù)最多分別占總體的38.5%和50.9%[1]。這些致病性微生物主要有沙門氏菌、肉毒桿菌、大腸埃希菌O157∶H7、副溶血性弧菌、單核細胞增生性李斯特菌等等。如何對致病性微生物進行快速檢測一直以來都是食品安全性研究的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)鑒定方法是實驗室經(jīng)典常規(guī)的檢測鑒定方法,但因其操作繁瑣,耗時長等缺點不能滿足人們對食品樣品進行快速準確檢測的要求。近年來,隨著分子生物技術的發(fā)展,分子生物學手段如PCR、DNA探針等已廣泛應用到了食源性致病菌的檢測中,節(jié)約了檢測時間,并提高了檢測靈敏度。但是分子生物學檢測手段都需要經(jīng)過樣品的前處理-增菌階段,仍然達不到快速檢測的要求。疏水網(wǎng)格濾膜技術(Hydrophobic Grid Membrane Filter,HG MF)是利用膜的疏水性黏附細菌細胞,膜的過濾作用截留細菌細胞,然后將膜進行培養(yǎng),最后檢測鑒定目的菌。HG MF可以處理大量樣品,節(jié)省富集時間,去除抑制因子,達到快速檢測目的。同時,HG MF與分子生物學或免疫學方法連用,可準確、快速檢測食源性致病菌。目前,在國際上,疏水網(wǎng)格濾膜技術已成功的應用于各種食源性致病菌的檢測中,如Brichata等[2]應用HG MF檢測了120個食品加工樣品中的沙門氏菌,最低檢測限達到了1.0 cfu/mL,Valdivieso等[3]應用HG MF和半固體培養(yǎng)基(SS M)連用檢測了1654個食品樣品中的空腸彎曲桿菌的存在情況。疏水網(wǎng)格濾膜技術自20世紀70年代發(fā)展至今,已成為歐美國家實驗室常用方法,加拿大將其列為官方正式檢測方法,美國FDA也將其作為細菌分析手冊采用的通用方法。但在我國,疏水網(wǎng)格濾膜技術在檢測方面的研究幾乎處于空白階段。所見報道只有李慧珠等[4]利用HG MF檢測飲料中的細菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)。本文擬就HG MF技術在食源性致病菌的檢測方面的研究進展作一概述,以期為HG MF以及延伸技術在食源性致病菌的快速檢測方面的應用提供新思路。況,結果表明,HG MF-TALO(Thin Agar Layer Oxyrase)可以有效地提高受損致病菌恢復生長的檢率(P＜0.05)。Sharpe等[10]研究指出,在葡萄和草莓的樣品中,采用普通平板法將樣品進行10～15倍稀釋可檢測到致病菌,而采用HG MF方法去除葡萄和草莓中存在的微生物生長抑制因子,稀釋50倍還可檢測到致病菌。文中結論指出:HG MF可以去除食品中的抑制因子;④采用HG MF過濾培養(yǎng)后,可直接獲得純培養(yǎng)“菌落”,然后進行菌落計數(shù),可達到定量檢測目的。HG MF具有1600個網(wǎng)格,由于網(wǎng)格的柵欄作用將細菌的生長嚴格限定在一定范圍內(nèi),每個小的網(wǎng)格小室內(nèi)僅能截留0～2個細菌細胞,經(jīng)培養(yǎng)后每個網(wǎng)格小室內(nèi)便形成比較單一的類似于菌落的“微小菌落”,通過這種方法進行菌落計數(shù),然后

1 HG MF技術的原理

1924年,Mudd[5]首次報道了細菌微生物細胞表面具有不同程度的疏水性,其物質基礎主要有表面蛋白、脂多糖、聚多糖、磷脂等。通過疏水相互作用,細菌細胞可以黏附到疏水性物質表面。疏水網(wǎng)格濾膜技術就是利用細菌的這一特性制成的有1600個疏水網(wǎng)格,孔徑為0.45μm的疏水性過濾膜。利用疏水網(wǎng)格濾膜技術,將食品樣品中存在的微生物細胞和受損細胞截留在疏水網(wǎng)格膜上,經(jīng)培養(yǎng)后,對目的菌進行鑒定分析,達到大量快速檢測食源性致病菌的目的。

HG MF技術的檢測程序:首先,將食品樣品進行均質處理,食品表面細菌被拍打到溶液中;將均質液進行預過濾,除去拍打時產(chǎn)生的顆粒性物質,以防影響后續(xù)操作;然后,將樣品液經(jīng)疏水網(wǎng)格濾膜抽濾;將膜轉移到選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng);最后,進行一些相關的檢測,鑒定。培養(yǎng)后的疏水網(wǎng)格濾膜還可以做相應的菌落計數(shù),從而可以為食品的安全性檢測提供定性定量的數(shù)據(jù)。

2 HG MF技術的特點

疏水網(wǎng)格濾膜技術的主要特點有:①可以同時處理大量樣品,節(jié)省勞動力。在對實際樣品檢測時,有時需要對大量的樣品進行檢測,做系統(tǒng)分析。這時,采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)的方法太過于繁瑣,任務量大,而采用HG MF抽真空過濾的方法方便快捷,可以批量處理膜,這樣就可以節(jié)省檢測工作量。Entis等[6]采用HG MF方法檢測沙門氏菌時,對798株人工污染和265株自然污染的食品樣品進行了處理。Doyle等[7]在采用HG MF-immunoblot檢測E.coliO157∶H7時,共分析了896個畜禽肉樣;②可以節(jié)省富集時間。Entis等[6]早在1982年發(fā)表的文章中指出,采用HG MF方法縮短檢測時間的程序:首先對樣品進行均質處理,在非選擇性的富集肉湯中過夜培養(yǎng)18～24 h,選擇性富集肉湯中培養(yǎng)6～8 h,經(jīng)HG MF過濾處理后涂布選擇性培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后檢測目的菌落,如無藍色菌落,檢測完成;如檢出陽性,再進行生化鑒定,確定其為沙門氏菌。運用此方法對食品樣品檢測沙門氏菌,僅用2～3 d,而采用Health Protection Branch培養(yǎng)方法需要3～4 d才能完成。Peterkin等[8]采用HG MF和酶聯(lián)免疫分析連用檢測葡萄球菌產(chǎn)腸毒株,將樣品進行均質處理,HG MF過濾,然后將濾膜置于腦心浸液瓊脂上培養(yǎng)24 h后免疫印跡檢測,在27 h內(nèi)完成檢測;③HG MF可解除樣品中某些成分的抑制作用,使受損細胞恢復生長,從而有效地檢測食品中存在潛在危害的微生物。如Vivian等[9]利用HG MF檢測細紋牛肉中的受損傷致病菌(Escherichia coli O157∶H7、Listeria monocytogenes、Sal monella Typhimurium和Yersinia enterocolitica)的恢復生長情與HG MF-MPN表比對[11],從而可以對樣品中目的菌含量進行初步的定量分析。

3 HG MF技術的研究現(xiàn)狀

20世紀70年代,最初的膜過濾(Membrane Filter,MF)技術[12]開始在實驗中使用。隨后,Peterkin等[13]研究過采用MF檢測4種食源性致病菌前,用胰蛋白酶和Tween-20預處理冷凍的食品樣品。Entis等[14]在檢測副溶血性弧菌時采用了改進的帶疏水網(wǎng)格的濾膜(Hydrophobic Grid Membrane Filter,HG MF)進行過濾、選擇性培養(yǎng)和復蘇性培養(yǎng)。Depaola等[15]比較了2種BAMMPN方法和2種MF方法來檢測副溶血性弧菌。檢測結果表明,HG MF的檢測特異性比BAM-MPN高(P＜0.05)。至此,HG MF技術逐漸成熟起來,并被作為標準檢測方法加以推廣和應用。AOAC International和American Public Health Association將HG MF技術列為標準好氧菌落計數(shù)方法,即將HG MF在含0.025%FCF的TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h進行計數(shù)[16-17]。Parrington等[18]基于綠色背景干擾計數(shù)結果的考慮,在其基礎上又做了相應的改進,將在TSA上培養(yǎng)過的HG MF,加入1～2 mL 0.1%的TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)在室溫下染色15 min,菌落變成紅色,用HG MF計數(shù)器可以方便地對其進行自動計數(shù)。

隨著這項技術廣泛的使用,人們也不斷對其進行創(chuàng)新和發(fā)展,并將其與實際研究工作相結合,聯(lián)合多種檢測技術用于食源性致病菌的檢測,達到優(yōu)勢互補的目的。借助HG MF技術中膜的載體作用,將其與目的菌的選擇性培養(yǎng)基聯(lián)用便是實驗室進行快速檢測的常規(guī)方法。此外,HG MF和一些分子生物學和免疫學技術聯(lián)用,可以達到更方便、快捷、靈敏檢測目標微生物的目的。

3.1 HGM F與選擇性培養(yǎng)基聯(lián)用的研究

HG MF從在食源性致病菌的檢測方面開始應用就與諸多選擇性培養(yǎng)基連用。Valdivieso等[3]根據(jù)嗜熱彎曲桿菌的特殊生長要求,采用HG MF和半固體培養(yǎng)基(SS M)連用檢測了1654個食品樣品中的空腸彎曲桿菌的存在情況。在16～18 h之后,可以得到純培養(yǎng)的彎曲桿菌,而采用FSPM (Food Safety Procedures Manual)要用48 h才能得到同樣的結果。Jericho等[19]采用HG MF-TSA培養(yǎng)后,噴霧1.0%TTC,檢測水平顯著提高(P＜0.001)。Rosa Capita等[20]用EF-18Agar-HG MF分析了來自于禽肉中沙門氏菌,和標準方法的比較發(fā)現(xiàn),EF-18Agar-HG MF在檢測禽肉中的沙門氏菌時靈敏度和特異性是不夠的。這說明只是通過選擇性平板進行檢測目的菌是不完善的。Mannig等[21]采用HG MF-Miller-Mallinson Agar和紅外光譜分析結合,在檢測實際的食品樣品(包括牛奶、雞蛋、西紅柿、雞肉等)時,沙門氏菌屬水平檢測達100%,菌株水平檢測達90%。

3.2 HGM F與免疫學技術聯(lián)用的研究

疏水網(wǎng)格濾膜偶聯(lián)酶標抗體著色(HG MFEnzyme Labeled Antibody)是利用細菌的表面抗原與特異性抗體的物理結合能力,根據(jù)酶標抗體的顯色反應,達到檢測已吸附在膜上的細菌細胞的目的。

Cerqueira-Campos等[22]研究了HG MF-ELA在檢測沙門氏菌時的應用,并與HPB方法進行了比較。將經(jīng)過濾處理的濾膜浸HRP-protein A Spicer-Edwards混合液,然后著色處理,可觀察到紫色菌落。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),HG MF可以直接浸抗體液,且著色深淺在對比明顯的背景下均可見,重現(xiàn)性好,但是在對54株沙門氏菌和11株非沙門氏菌的檢測過程,Citrobacter freundii出現(xiàn)了假陽性現(xiàn)象。Todd等[23]為了找到在沙門氏菌中能進行HMGF-ELA的最佳抗血清,篩選了566株來自于11個血清型的沙門氏菌。實驗中,他們將經(jīng)過濾培養(yǎng)的HG MF用多種化學試劑處理,以便能更好地暴露菌體細胞表面的抗原決定簇,方便其和多抗或單抗的特異性結合。實驗結果表明,2個單克隆抗體S.typhi 42和M105表現(xiàn)出了和沙門氏菌屬細菌強的結合特異性。

隨著免疫學技術的發(fā)展,單克隆抗體得到更加廣泛的使用。Szabo等[24]利用單克隆抗體進行HG MF-ELA檢測E.coliO157∶H7得到了比較好的檢測靈敏度(≤cfu/g),是傳統(tǒng)涂平板法的10倍。但是又出現(xiàn)了新的問題,由于被檢樣品的顏色污染,混淆了陽性菌株的篩選,因此將HG MF轉印到新的培養(yǎng)基上,復蘇率可重新獲得提高。Todd等[25]利用針對O抗原的單克隆抗體與HG MF技術偶聯(lián)來檢測食品樣品中的E.coli O157∶H7。檢測結果與預期相符合,在對人工污染樣品的檢測中,E.coliO157∶H7的復蘇率達到了95%。

3.3 HGM F與分子生物學技術聯(lián)用的研究

疏水網(wǎng)格濾膜偶聯(lián)菌落原位雜交(HG MFColony Hybridization)是直接將經(jīng)過處理的濾膜進行DNA雜交的后續(xù)操作,即裂解細胞、釋放DNA、去除蛋白的干擾、加入帶有標記的DNA探針,從而對目的菌進行特異性檢測。

3.3.1 單核細胞增生李斯特菌的檢測 單核細胞增生李斯特菌(L.m onocytogenes)是一種人畜共患病的病原菌,廣泛存在于自然界中,且在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。將HG MF與菌落原位雜交技術偶聯(lián)應用于對L.m onocytogenes的研究始于1989年,Peterkin等[26]采用HG MF技術從L. m onocytogenes基因庫的7個克隆的β-溶血素基因中篩選特異性的DNA探針,結果表明該篩選方法有潛在的應用價值。1991年,Peterkin等[27]又比較了采用纖維素膜和疏水網(wǎng)格濾膜做為探針雜交載體的不同。研究結果表明,HG MF-CH和傳統(tǒng)的菌落原位雜交方法無差距,但因HG MF-CH技術集合了疏水網(wǎng)格濾膜的特點,與后者相比具有明顯的優(yōu)勢。隨后,他們又比較了應用HG MFCH方法和HPB方法檢測人工污染的食品樣品中L.m onocytogenes的存在情況。將食品樣品分別與L.m onocytogenes、L.innocua、L.welshim eri或L.seeligeri進行培養(yǎng)(人工污染水平為1～100 cells/g),HG MF計數(shù)結果表明,與HPB方法相比沒有顯著差異(a=0.05)[28]。W.Yan等[29]采用地高辛標記的DNA探針和HG MF連用,檢測200個食品樣品中的L.m onocytogenes,與HPB方法相比,檢測特異性達到了100%,靈敏度達到了94%。

3.3.2 空腸彎曲桿菌的檢測 Lai-King等[30]采用1475 bp的基因探針pDT1720和孔徑為0.22 μm的HG MF聯(lián)用對Cam pylobacter進行菌落原位雜交。在對來自于環(huán)境和臨床菌株以及310株其他菌株的檢測中,C.jejuni和C.jejunisubsp. doylei isolates在嚴格的雜交條件下可以和探針產(chǎn)生雜交信號。Haiyan Wang等[31]也比較過HG MF-ELA和HG MF-DNA hybridization等快速檢測技術在對食品樣品中的嗜熱性Campylobacter spp.和C.jejuni的應用。

3.3.3 其他食源性致病菌的檢測 Todd等[32]采用地高辛標記的志賀式樣毒素基因的特異性探針與HG MF連用檢測Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC),純培養(yǎng)菌株和人工污染的菌株檢測限都達到了0.1 cfu/g。文中還指出,對于食品樣品中低水平存在的VTEC可有效檢出。

在對產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌的研究中,Annamari等[33]成功地利用HG MF-CH技術在糞便中分離得到cpe-positive Clostridium perfringens孢子。文中指出,在來自于健康人體的7份糞便中,有2份檢測到HG MF-CH雜交信號,并且成功分離到了cpe-positive C.perfringens菌株。HG MFCH方法對cpe-positive C.perfringens菌株的檢出分辨率達到了6×10-6或更高。

4 HG MF技術發(fā)展展望

食源性致病菌是危害公共衛(wèi)生安全的重要隱患。快速的微生物檢測是評價食品安全的重要手段之一。微生物檢測與食品中其他的化學物質檢測不同的一點是,微生物檢測的操作步驟中需要增菌的過程,任何檢測方法都不能省略此步驟,但是其所耗時間卻是可以縮短的。而目前,國內(nèi)在食源性致病菌快速檢測方面的研究主要集中于對檢測方法的改進和創(chuàng)新,且在富集增菌方面縮短時間的免疫磁珠法也并不能解決處理批量樣品的問題。疏水網(wǎng)格濾膜技術除具有縮短富集培養(yǎng)時間,處理大量樣品外,還可以獲得純培養(yǎng)菌落,消除食品樣品中的抑制因子,使受損細胞得以生長并被檢出,從而為食源性致病菌的安全風險評估提供可靠的數(shù)據(jù)。而且HG MF的檢測對象不僅僅局限于流質性樣品如飲料、飲用水等,同時也適用于可采用均質處理的其他樣品,如蔬菜、乳制品、畜禽肉、以及腸內(nèi)容物等。另外,HG MF技術和其他的技術的偶聯(lián)效果更是不容忽視。目前,基于HG MF過濾富集過程之上,采用什么方法對其進行菌株的鑒定和檢測是研究的方向。前人的研究中,DNA-CH的方法比較耗時,現(xiàn)在利用菌落原位雜交的特異性和省時的特點,設計新的思路結合二者的優(yōu)點在快速檢測的時間限和靈敏度上有所突破應是今后改進該系統(tǒng)的一套新思路。

利用新型的生物技術手段,聯(lián)合這種基于傳統(tǒng)微生物分析方法之上的富集分離技術,不僅能給檢測方法的研究帶來新的啟發(fā),而且能夠解決實際樣品檢測的繁重任務,是未來發(fā)展的一條新思路。

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The Advances of Hydrophobic Grid Membrane Filter Technology and Its Application in Foodborne Pathogens Determination

SU Chen-xi1,PAN Ying-jie1,ZHAO Yong1,Vivian C.H.Wu2,SUN Xiao-hong1
(1.Coll.of Food Sci.&Technol.,Shanghai Ocean Uni.,Shanghai201306; 2.Dept.of Food Sci.&Human Nutrition,Uni.of M aine,M E04469-5735,USA)

Based on the hydrophobic interaction,the hydrophobic grid membrane filter(HG MF)could filter food samples,and capture bacterial cells which then were incubated on the selective medium for testing and identifying them.The principle and features of the HG MF were mainly summarized.The application of HG MF coupling with molecular biology and immunology in detection of foodborne pathogens was also introduced in this paper.

hydrophobic grid membrane filter(HG MF);microbiological detection;enzyme labeled antibody;DNA probe;colony hybridization

Q93-332

A

1005-7021(2010)06-0076-06

霍英東教育基金會第十一屆高等院校優(yōu)選資助課題(114035);上海市科技興農(nóng)重點攻關項目(滬農(nóng)科攻字2009年第6-1號);上海市教育委員會重點學科建設項目(J50704)

蘇晨曦 女,碩士研究生。研究方向為食品生物技術。E-mail:chenxisu2010@163.com

＊通訊作者。E-mail:xhsun@shou.edu.cn

2010-04-29;

2010-11-01