尿液蛋白質(zhì)分離檢測及臨床意義的研究進(jìn)展

王洪禮，寧 莉 綜述，魏殿軍 審校

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，天津 300211）

尿液蛋白檢測及特性的鑒定對評價泌尿系統(tǒng)的功能和疾病非常重要。尿蛋白含量的檢測方法很多，因檢測方法和技術(shù)特性不同，其對尿蛋白的敏感性和特異性也不同。以往采用免疫化學(xué)方法檢測尿微量白蛋白（mAlb）對腎臟損害作評價較尿常規(guī)、腎功能檢查敏感，已被臨床醫(yī)生接受[1]。近來國外有報道發(fā)現(xiàn)用高效液相色譜（HPLC）法測定尿中非免疫活性白蛋白（INUA）能更早期地提示糖尿病腎臟損害，而采用常規(guī)免疫化學(xué)法不能測定之。因此，現(xiàn)階段如何更好地分離和篩選尿蛋白檢測指標(biāo)對臨床相關(guān)疾病的診斷具有非常重要的意義[2]。

1 尿液蛋白質(zhì)的分類和臨床特性

尿液中的蛋白質(zhì)是非常復(fù)雜的，它們以多種形式存在。傳統(tǒng)意義上，根據(jù)蛋白分子量的不同，將尿蛋白分為小分子蛋白（β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白）、中分子蛋白（白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白）、大分子蛋白（IgG、IgA、IgM、α2－巨球蛋白）。近年來，根據(jù)尿白蛋白的免疫活性又將其分為有免疫反應(yīng)活性的白蛋白和非免疫活性白蛋白兩類。而利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法可鑒定出來的尿蛋白質(zhì)有171個，這包括5個男性特異性蛋白質(zhì)——前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶前體、前列腺分化因子、精子形成蛋白Ⅰ和精子形成蛋白Ⅱ的前體，同時還鑒定出12個低分子量蛋白質(zhì)（<10 kDa）。蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出來的尿蛋白質(zhì)大部分分子量范圍為30~60 kDa，等電點范圍為4~10[3]。

臨床上最常用的尿液蛋白質(zhì)的檢測方法是免疫比濁法(RIA)。近年來發(fā)現(xiàn)HPLC法測定的白蛋白總量遠(yuǎn)超過RIA法測定的白蛋白濃度，因而推斷有大量其他形式的白蛋白存在，其中包括非免疫活性白蛋白。非免疫活性白蛋白也是人體白蛋白成分，在尿液中大量存在，其分子與人血清白蛋白的大小相同，利用傳統(tǒng)的抗人血清白蛋白抗體法不能檢測出來。它們由多肽鏈組成，可被蛋白酶水解，其間通過二硫鍵和非共價鍵連接。這些白蛋白很可能是在通過腎臟的過程中形成，但也不排除血中含有少量該物質(zhì)并被腎臟清除。研究表明，糖尿病人由無蛋白尿進(jìn)展至微量蛋白尿期，尿中非免疫活性蛋白水平逐漸增高。Osicka等[4]對糖尿病人尿液非免疫活性白蛋白檢測后發(fā)現(xiàn)該指標(biāo)可將1和2型糖尿病人出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿的危險性預(yù)測分別提前3.9年和2.4年。

2 尿液蛋白質(zhì)分離技術(shù)

尿液蛋白質(zhì)分離通常采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳，此外用于蛋白質(zhì)組分離的技術(shù)還有二維層析、熒光差異顯示雙向電泳、二維液相分離和同位素親和標(biāo)記等方法。

2.1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（2-DE） 是使用最廣泛的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，具有很高的分辨率，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中的核心技術(shù)之一。其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量的差異使之在二維平面上分開。目前，最多可分離到11 000個左右蛋白樣點。盡管雙向電泳技術(shù)近幾年已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，是當(dāng)前蛋白質(zhì)分離的最常用技術(shù)，但其本身還有一些難以克服的問題[5-6]。

2.2 毛細(xì)管電泳（CE） 其中應(yīng)用較為廣泛的是毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）（依據(jù)不同蛋白質(zhì)的電荷質(zhì)量比的差異實現(xiàn)分離）、毛細(xì)管等電聚焦（依據(jù)蛋白質(zhì)等電點不同在毛細(xì)管內(nèi)形成pH梯度而實現(xiàn)分離）和毛細(xì)管電色譜（毛細(xì)管電泳和液相色譜的融合技術(shù)）。CE具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、分離自動化和成本消耗少等優(yōu)點。毛細(xì)管電色譜是近年發(fā)展起來的一種新型微分離分析技術(shù)，它整合了毛細(xì)管電泳與微徑柱液相色譜的優(yōu)點，通過在填充微細(xì)顆粒液相色譜填料的微徑柱色譜柱兩端施加直流高壓電場，達(dá)到其對痕量復(fù)雜生物及化學(xué)體系樣品優(yōu)越的分離能力。

2.3 二維色譜技術(shù) 二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式，第一維色譜多為離子交換色譜，也有凝膠過濾色譜，第二維通常是反相色譜，反相色譜采用反相有機(jī)溶劑作流動相，從而避免了鹽等添加劑對后續(xù)質(zhì)譜分析的影響。這種技術(shù)最大優(yōu)勢是可以避開相對分子質(zhì)量和等電點的限制。作為一種新的技術(shù)，它的主要問題是分辨率和重現(xiàn)性尚不能與二維凝膠電泳相比。

3 尿蛋白檢測的幾種方法

由于總蛋白測定無法區(qū)分腎小球和腎小管型蛋白尿，Ellis和Buffone建議通過測定不同性質(zhì)的尿白蛋白來確定腎小球來源的病理性。尿白蛋白檢測包括傳統(tǒng)的磺基水楊酸法、加熱乙酸法、沉淀法、比濁法等。這些方法測定尿白蛋白具有一定局限性，如溴酚藍(lán)作為染料結(jié)合劑測定尿白蛋白時穩(wěn)定性差，即便在30 s內(nèi)完成比色，受球蛋白的干擾仍較大；常規(guī)應(yīng)用的免疫比濁法在測定<6mg/L的尿液白蛋白時不夠敏感。理想的測量腎臟排泄蛋白質(zhì)的選擇能力時，應(yīng)該用分子大小很不一致的蛋白質(zhì)。散射免疫比濁法與免疫電泳技術(shù)已常用于尿液中各種蛋白質(zhì)的定量；聚丙烯酰胺凝膠電泳可測量分子大小不一的蛋白質(zhì)的大致比例；放射免疫試驗用于尿液中白蛋白、IgG、β2-微球蛋白的定量測定；濁度法可測定尿液中各種血漿蛋白質(zhì)。除常用方法外，本文再具體分析幾種檢測尿液蛋白質(zhì)的新方法。

3.1 HPLC HPLC法測定尿液蛋白質(zhì)具有高效和高的重現(xiàn)性，分析時間短，親水的二醇鍵合相，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的良好回收率。使用寬的pH范圍（pH3~8）色譜柱與流動相中有機(jī)改性劑和變性劑相兼容，消除了蛋白質(zhì)的聚合，從而實現(xiàn)正確的蛋白質(zhì)分子量測定。用于包括蛋白質(zhì)單體、二聚體和聚合體的分離、脫鹽、蛋白質(zhì)分子量估算和改性蛋白質(zhì)的分離。而新的HPLC檢測方法比RIA法對早期高危病人的預(yù)測更可行、更敏感[7]。HPLC可檢測尿液中免疫活性和非免疫活性蛋白質(zhì)，檢測出微量蛋白尿以下的尿蛋白水平，而常規(guī)檢測方法不利于合并其他心血管疾病和代謝疾病的風(fēng)險預(yù)測。

3.2 CZE CZE具有高效、快速、微量、多模式、經(jīng)濟(jì)、自動化及潔凈等優(yōu)點，是一種快速、高分辨、高靈敏的尿蛋白質(zhì)檢測方法[8]。堿性緩沖液中（pH=9.0）各種蛋白質(zhì)都帶負(fù)電,向陽極泳動。但在強(qiáng)力的電滲流的作用下，實際電泳中向陰極泳動。通過紫外檢測器檢測信號，最終將其制成電泳圖譜。根據(jù)圖譜中峰面積換算成蛋白含量。本法可在8min內(nèi)將尿蛋白電泳分離，其中兩個主要的峰1號峰為肌酐峰，3號峰為尿白蛋白峰。但毛細(xì)管電泳儀進(jìn)樣時精度較HPLC低，定量分析時以用內(nèi)標(biāo)法為宜[9]。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展主要依賴于高通量分離和分析技術(shù)的突破性進(jìn)步。首先是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的日益完善，使得蛋白質(zhì)的高通量分析成為可能。其次是質(zhì)譜技術(shù)，現(xiàn)已成為檢測蛋白質(zhì)分子的重要手段。最后是生物信息學(xué)的建立使得國際性的科學(xué)大協(xié)作得以形成。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，將對生命科學(xué)的發(fā)展起到重要的推動作用。尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究對于研究器官功能，尤其是腎臟和泌尿道功能具有重要意義。目前對尿蛋白質(zhì)組已有一些研究，但這些研究所鑒定出的結(jié)果間差別很大。當(dāng)前的低重現(xiàn)性是由樣品本身的差異造成的，還是由樣品處理、分離和鑒定方法不同造成的，或者這幾方面因素都有作用，尚不清楚。另一方面，在鑒定出的尿蛋白質(zhì)組中低分子量蛋白質(zhì)(<10 kDa)很少，還需要進(jìn)一步全面地進(jìn)行分析[10]。

4 尿液中幾種特殊蛋白質(zhì)的測定意義

4.1 非免疫活性白蛋白 HPLC 法與RIA比較，可以檢測所有完整的白蛋白片斷，其檢測微量白蛋白的量是RIA的2~3倍，HPLC比RIA對高危病人早期腎臟損傷的預(yù)測更敏感、更可行。臨床醫(yī)生完全可有把握的通過檢驗報告中精確的尿微量白蛋白對疾病嚴(yán)格定級并可以有效的監(jiān)測治療效果[11]；同時還能夠發(fā)現(xiàn)更多存在危險因素的患者，這對大范圍人群的篩查非常有意義[12]。尿中非免疫活性白蛋白的檢測對糖尿病腎臟疾病以及心血管疾病的早期診斷具有極大的臨床意義[13]。

4.2 白蛋白 尿中白蛋白增加提示腎小球基底膜有病理通透性改變，是球性蛋白尿的主要標(biāo)志；也是糖尿病及高血壓并發(fā)腎臟損傷的早期指征[14]。持續(xù)性微量蛋白尿較尿常規(guī)和血清腎功能檢查更敏感，也是反映腎小球功能的一個非常敏感的指標(biāo)。有很多方法可以檢測尿中白蛋白的含量，檢測范圍從極低含量的微量蛋白尿到含量極高的大量蛋白尿。新的患者經(jīng)常來測定尿中微量白蛋白作為原始資料。如果陽性，應(yīng)該每年測定尿中白蛋白：肌氨酸酐。所有腎臟疾病、糖尿病、高血壓、代謝綜合征的患者應(yīng)該測定尿中白蛋白。

4.3 IgG 正常尿蛋白中白蛋白約占30%～40%，IgG占5%～10%，輕鏈5%，IgA3%，其余約40%為Tam-Horsfall等蛋白，在正常情況下，檢測不出大分子蛋白，如IgD和IgM等[15]。有研究報道，臨床試驗對80例原發(fā)性腎小球腎炎進(jìn)行尿Ig檢測。尿IgG的檢出率為86.25%，其中慢性腎炎和腎病綜合征檢出率為100%，84.5%>0.10g/L；急性腎炎和隱匿性腎小球疾病檢出率為50%，有91.9%<0.10 g/L，兩者差別有非常顯著意義(P<0.01)。尿IgA檢出率為32.5%,其中腎病綜合征檢出率為62.5%，急性腎炎和隱匿性腎小球疾病均未檢出，尿IgM僅檢出1例。

4.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF） TRF對早期診斷糖尿病腎病具有良好的診斷價值，尿TRF是一種腎小球濾過功能不全的敏感指標(biāo)。目前更多證據(jù)表明，糖尿病尿液白蛋白增加之前，尿液TRF已開始升高[16]。

4.5 視黃醇結(jié)合蛋白（URBP） URBP可早期敏感地反映腎盂腎炎的腎損傷程度，且URBP敏感性高于β2-MG。同時，URBP也是診斷高血壓病早期腎損害的更敏感指標(biāo)。肺心病患者存在腎功能的損害,動態(tài)觀察URBP水平變化是判斷其早期腎功能損害的敏感方法,能夠早期發(fā)現(xiàn)肺心病患者的腎功能損害及程度[17]。

4.6 α1酸性糖蛋白（α1AGP） α1AGP又稱血清類粘蛋白，是一種急性時相蛋白（acute phase proteins）。早期認(rèn)為只有肝臟能合成和分泌,最近發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞也能分泌α1AGP。在組織損傷和感染、炎癥反應(yīng)時血清值增高,尤以慢性炎癥為著,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、燒傷、腫瘤時增加也較明顯[18]。α1AGP水平與肝臟病變的范圍和損害程度明顯相關(guān)，動態(tài)觀察可作為判斷病情預(yù)后的一項生化指標(biāo)；對肝炎、肝硬化和肝癌的鑒別診斷有一定的輔助意義。這種糖蛋白可大量結(jié)合堿性藥物如喹啉，其濃度增加可減少血清中此類游離藥物的濃度，影響藥物的作用。

采用何種方式測定尿中蛋白質(zhì)含量，應(yīng)根據(jù)具體情況分析[19]。但對于通常的病人，為評價腎臟病理性損傷及其他器官對腎臟的影響，應(yīng)在測定微量白蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇其他蛋白質(zhì)進(jìn)行測定，尤其需要建立簡便、快速、特異的非免疫活性尿蛋白的測定方法，及早預(yù)報腎臟病理損傷，為臨床糖尿病的早期干預(yù)贏得時間，減少因腎臟損害而進(jìn)入終末期糖尿病人的發(fā)病數(shù)。

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