高效液相色譜法測(cè)定家兔血漿中苦參堿的濃度

劉衛(wèi)平，李艷輝

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410219）

苦參堿系從豆科槐屬植物苦參、山豆根和苦豆子中提取、分離、純化制得的生物堿，具有抗病毒、抗肝纖維化、升高白細(xì)胞、增強(qiáng)免疫力等藥理作用和功效，臨床主要用于治療病毒性肝炎[1,2]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定家兔血漿中苦參堿濃度，方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于苦參堿納米粒家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究，并為苦參堿納米粒的體內(nèi)分布試驗(yàn)提供參考。

1 儀器與材料

LC－10ATVP－ODS型高效液相色譜儀，包括SPD－10AVP紫外檢測(cè)器 (日本島津)；LDZ4-0.8自動(dòng)平衡離心機(jī) (北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；XW-80A漩渦混合器 (上海精科實(shí)業(yè)有限公司)?？鄥A對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)10256-0203)；苦參堿原藥(寧夏紫荊花藥業(yè)公司鹽池藥廠，含量98.2%，批號(hào)6010829)；甲醇為色譜純，乙醚等為分析純。家兔(2～3kg，長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AICHROM-SiO2柱 (4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-三乙胺(每100mL甲醇加3μL三乙胺)；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取苦參堿對(duì)照品25mg，置于10mL量瓶中，加甲醇10mL溶解并定容至刻度，即得2.5mg/mL的苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。4℃冷藏備用。使用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 血漿處理方法

精密吸取家兔含藥血漿樣品1.0mL，置10mL離心管中，加蒸餾水1.0mL，20%氫氧化鈉溶液0.5mL，混勻加入乙醚3mL，漩渦30s，離心5min (4000r/min)，分取乙醚層于試管中，45℃水浴中氮?dú)獯蹈?，將殘留物?zhǔn)確用100μL甲醇溶解，取20μL進(jìn)樣。

2.4 方法專屬性

在選定的色譜條件下，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，苦參堿峰形良好，分離完全，其保留時(shí)間為4.5min。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

取離心管數(shù)支，分別加20 μL苦參堿系列濃度對(duì)照品溶液，氮?dú)獯蹈?，再加?mL空白血漿，配制成終質(zhì)量濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、20、50μg/mL的血漿樣品。按"2.3"項(xiàng)處理血漿樣品，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定樣品中苦參堿峰面積，以峰面積A對(duì)血漿濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A＝36828C+6816.4，r＝0.9998。結(jié)果表明，苦參堿血漿質(zhì)量濃度在0.1～50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.1μg/mL。

2.6 精密度與回收率試驗(yàn)

取離心管數(shù)支，分別加20 μL苦參堿對(duì)照品系列溶液，氮?dú)獯蹈?，再加?mL空白血漿，配制成終質(zhì)量濃度為0.2、1.0、50μg/mL的血漿樣品。按" 2.3"項(xiàng)處理血漿樣品，進(jìn)樣20 μL。同一天內(nèi)每個(gè)濃度平行配制5份，計(jì)算日內(nèi)精密度和回收率。連續(xù)3d內(nèi)每個(gè)濃度各平行配制5份，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取離心管數(shù)支，分別加20 μL苦參堿對(duì)照品系列溶液，氮?dú)獯蹈?，再加?mL空白血漿，配制成終質(zhì)量濃度為0.2、1.0、50μg/mL的血漿樣品，分別于配制當(dāng)天室溫放置6h、-20℃下反復(fù)凍融和冷凍20d，按"2.3"項(xiàng)處理血漿樣品，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定，以考察樣品在不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 精密度試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 討論

苦參堿的含量測(cè)定方法有多種，文獻(xiàn)報(bào)道主要有HPLC法、薄層掃描法、酸性染料比色法和高效毛細(xì)管電泳法等[3-6]。其中HPLC法測(cè)定時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道有用C18柱[7]和氨基鍵合柱[3]，本研究采用AICHROMSiO2柱，甲醇為流動(dòng)相，在流動(dòng)相中加入三乙胺，峰形明顯改善，且分離度也較滿意。

苦參堿為一弱堿性藥物，在堿性條件下采用有機(jī)溶劑提取。文獻(xiàn)報(bào)道有用氯仿-正丁醇混合溶劑提取[8]，本實(shí)驗(yàn)采用乙醚提取也得到了理想的結(jié)果。

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[2]葉明.苦參堿注射液的藥理研究 [J].廣東醫(yī)學(xué),1997,18 (11):793.

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[4]姜建芳,余瀅,祝永明,等.薄層掃描法測(cè)定利咽顆粒中苦參堿的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(12):1788-1789.

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