NaDC3過表達(dá)對(duì)人腎小管細(xì)胞能量代謝和活性氧產(chǎn)生的影響＊

馬玉香, 白雪源, 汪 揚(yáng), 馮 哲, 傅 博, 陳香美

(1北京大學(xué)首鋼醫(yī)院腎內(nèi)科,北京 100144;2解放軍總醫(yī)院腎病科暨全軍腎病研究所,北京 100853)

高親和力鈉離子依賴性二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(highaffinity sodium-dependent dicarboxylate transporter, NaDC3)是負(fù)責(zé)將三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸 (succinate)等轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)參加 ATP合成的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是調(diào)控能量代謝的一種關(guān)鍵性膜蛋白質(zhì)[1]。主要在有氧能量代謝 (aerobic energy metabolis m)非?；钴S的組織如腎小管上皮、肝、腦及胎盤表達(dá)[2]。目前對(duì)于NaDC3的功能并不太清楚。

近端腎小管是原尿中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、葡糖糖等重吸收的主要部位,但與大腦類似,其無氧糖酵解能力很低,高度依賴有氧代謝產(chǎn)生 ATP。而許多研究已表明有氧代謝活動(dòng)非?；钴S的組織其活性氧類 (reactive oxygen species,ROS)的生產(chǎn)量也多,因此這些組織更易受到 ROS的氧化性損害 (oxidative damage)。由于 NaDC3主要表達(dá)在近端腎小管上皮細(xì)胞,那么如果其表達(dá)過高,是否能通過轉(zhuǎn)運(yùn)過多的三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物、加快三羧酸循環(huán)的速率、促進(jìn) ROS過多產(chǎn)生從而對(duì)腎小管造成氧化應(yīng)激性損傷?目前并不清楚。本研究中我們將NaDC3基因?qū)肴私四I小管上皮細(xì)胞中過表達(dá),觀察其對(duì)細(xì)胞能量代謝和 ROS產(chǎn)生的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

人近端腎小管上皮細(xì)胞系 (human kidney cells, HKC)培養(yǎng)于含 0.9 mmol/L丙酮酸鈉及 10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基(Gibco)中。

2 重組 NaDC3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染細(xì)胞

將細(xì)胞接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合度時(shí),分別加入重組NaDC3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 LNCX2-NaDC3[3]、對(duì)照病毒載體 LNCX2 -neo及 polybrene(8 mg/L)感染 12 h。感染后48 h取細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

3 W estern blotting檢測(cè)細(xì)胞 NaDC3蛋白的表達(dá)

用RAPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,用Micro BCA protein kit(Pierce)測(cè)蛋白濃度。取 100μg樣品經(jīng)煮沸5 min后10%SDS-PAGE電泳,采用電轉(zhuǎn)印方法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后在含 1×酪蛋白的 PBS中 4℃封閉過夜,分別加1∶1 000的兔抗人NaDC3多抗,室溫反應(yīng) 5 h,用 TBST充分洗滌后加 1∶1 000 HRP標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗室溫反應(yīng) 1 h,洗膜后用 ECL系統(tǒng)顯示抗體結(jié)合。用β-actin作為Western blotting的內(nèi)對(duì)照,以羊抗人β-actin多抗(C-11克隆,Santa Cruz)檢測(cè)β-actin的表達(dá)。

4 三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

用同位素[3H]標(biāo)記的琥珀酸作為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的代表進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)[3H]-琥珀酸的濃度研究 NaDC3蛋白對(duì)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)水平。每孔細(xì)胞用 2 mL膽堿緩沖液[140 mmol/L氯化膽堿,5.4 mmol/L KCl,1.8 mmol/L CaCl2,1 mmol/LMgCl2,25 mmol/L Hepes-Tris(pH7.4)]洗 1次以去除培養(yǎng)基成分。在轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液(用 140 mmol/L NaCl代替膽堿緩沖液中的 140 mmol/L氯化膽堿)中加入 40 nmol/L的 [3H]-琥珀酸(Du PontNEN)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)10 min,然后吸去轉(zhuǎn)運(yùn)液,用2 mL膽堿緩沖液洗細(xì)胞 1次,用 500μL 1%SDS(溶于 0.2 mol/L NaOH中)裂解細(xì)胞,然后進(jìn)行液閃測(cè)定。

5 感染腎小管細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)氧耗量的測(cè)定

將各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液,輕輕刮取單層細(xì)胞,懸浮于 1 mL 37°C預(yù)溫的DMEM培養(yǎng)基中,混勻后轉(zhuǎn)至氧耗量測(cè)量器中,用 Clark電極法測(cè)細(xì)胞氧耗量[4]。

6 細(xì)胞內(nèi) ATP含量的測(cè)定

用反相 -高壓液相儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi) ATP含量[5]。棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷 PBS洗 2次細(xì)胞,輕輕刮取單層細(xì)胞,0.5 mL PBS懸浮混勻后,加預(yù)冷的等體積 6%高氯酸,混勻,置冰上10 min,4℃1 000×g離心5 min,上清液用 6 mol/L KOH中和,調(diào) pH7.0,置冰上10 min,再次 4℃10 000×g離心 5 min,上清液上機(jī),用 HP1050高壓液相儀檢測(cè)。色譜柱為 ZobarXC -18短柱,流速 1 mL/min,紫外檢測(cè)器檢測(cè),波長(zhǎng)259 nm。

7 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位改變

將細(xì)胞接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿(MatTek)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在預(yù)溫的新鮮MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為 10 mg/L的熒光探針 JC-1,混勻后加入培養(yǎng)皿,避光 37℃孵育 10 min,用預(yù)溫的 Hanks液洗 2次,上機(jī)檢測(cè)。

8 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS含量

將細(xì)胞接種于玻璃平底的激光共聚焦專用平皿中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用 37℃預(yù)溫的 PBS洗細(xì)胞 1次,然后與10μmol/L的熒光染料 CM-H2DCFDA(Molecular Probes)孵育 30 min,最后用激光共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞內(nèi)的 ROS水平,激發(fā)波長(zhǎng) 480 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 505-530 nm。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用 t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 外源 NaDC3蛋白在 HKC中的表達(dá)鑒定

分別用重組NaDC3逆轉(zhuǎn)錄病毒和對(duì)照病毒載體感染 HKC,用Western blotting分析感染細(xì)胞中外源NaDC3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,在未感染細(xì)胞以及對(duì)照載體感染細(xì)胞中有低水平的NaDC3蛋白表達(dá),當(dāng)導(dǎo)入外源NaDC3基因后可使細(xì)胞內(nèi)NaDC3蛋白的表達(dá)水平明顯增加,見圖 1。

Fig 1 Detection of NaDC3 protein expression in the HKC by Western blotting.A:the uninfected cells;B:the cells infected with control vector;C:the cells infected with the NaDC3 retrovirus. ±s,n=3.＊P＜0.05vsuntransfected and control vector-transfected cells.圖 1 W estern blotting檢測(cè) HKC NaDC3蛋白的表達(dá)

2 NaDC3過表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)[3H]-琥珀酸水平的影響

同位素轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)顯示,NaDC3病毒感染細(xì)胞內(nèi)的[3H]-琥珀酸水平明顯高于 2個(gè)對(duì)照組細(xì)胞,見圖 2,表明NaDC3過表達(dá)可顯著促進(jìn)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。

Fig 2 Determination of[3H]-succinate level in the NaDC3 retrovirus-infected cellswith transport assay.±s.n= 3.＊P＜0.05vsuntransfected and control vector-transfected cells.圖 2 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)測(cè)定 NaDC3病毒感染細(xì)胞內(nèi)[3H]-琥珀酸的水平

3 NaDC3過表達(dá)對(duì)細(xì)胞氧耗量的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示,NaDC3病毒感染細(xì)胞中的基礎(chǔ)氧耗量明顯高于未感染細(xì)胞以及對(duì)照載體感染細(xì)胞的基礎(chǔ)氧耗量,見圖 3。

4 NaDC3過表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi) ATP濃度的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示,NaDC3病毒感染細(xì)胞中的 ATP含量為(20.7±1.6)μmol/g protein,未感染細(xì)胞以及對(duì)照載體感染細(xì)胞內(nèi)的ATP含量分別為 12.7±1.2和(12.9±0.9)μmol/g protein。顯示NaDC3感染組細(xì)胞中的ATP含量明顯增高(n=3,P＜0.01)。

5 細(xì)胞線粒體膜電位的改變

我們用熒光探針 JC-1結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察了NaDC3感染細(xì)胞的線粒體膜電位變化。一般在低膜電位時(shí)細(xì)胞主要發(fā)射綠色熒光;高膜電位時(shí)則轉(zhuǎn)為發(fā)紅色熒光;紅、綠熒光疊加后則顯示橙色熒光。檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組細(xì)胞大多發(fā)橙色熒光,NaDC3病毒感染細(xì)胞主要發(fā)紅色熒光。表明NaDC3蛋白短期內(nèi)過表達(dá)可使細(xì)胞線粒體膜電位增加,見圖 4。

Fig 3 Effect of NaDC3 on oxygen consumption in the NaDC3 retrovirus-infected HKCwas detected by Clark electrode method.±s.n=3.＊P＜0.05vsuntransfected and control vector-transfected cells.圖 3 Clark電極法檢測(cè) NaDC3對(duì) HKC氧耗量的影響

Fig 4 Detection of mitochondrial membrane potential in the NaDC3 retrovirus-infected cellswith laser confocalmicroscope.A:the uninfected cells;B:the cells infected with control vector;C: the cells infected with the NaDC3 retrovirus.圖 4 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè) NaDC3感染細(xì)胞的線粒體膜電位

6 NaDC3過表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi) ROS產(chǎn)生水平的影響

激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示,NaDC3病毒感染細(xì)胞中 ROS含量為 1 848.03±48.90(以熒光強(qiáng)度表示),明顯高于未感染細(xì)胞的 452.99±26.88及對(duì)照載體感染細(xì)胞的 433.36±44.21。表明NaDC3感染組細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生量明顯增加(n=3,P＜0.01),見圖5。

Fig 5 Detection of ROS content in the NaDC3 retrovirus-infected cellswith laser confocalmicroscope.A:the uninfected cells;B:the cells infected with control vector;C:the cells infected with the NaDC3 retrovirus.圖 5 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè) NaDC3病毒感染細(xì)胞內(nèi) ROS的含量

討 論

人腎臟近端腎小管在重吸收從血液中濾出的各種小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、氨基酸和無機(jī)離子的過程中發(fā)揮著非常重要的作用,因此,其需要消耗大量的ATP能量以保證完成其重要的重吸收功能。但是在生理狀態(tài)下,近端腎小管通過無氧酵解產(chǎn)生ATP的能力很低,高度依賴有氧代謝合成 ATP。近端腎小管上皮細(xì)胞含有豐富的NaDC3、鈉/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT1)等多種與能量代謝有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,使近端腎小管上皮比腎臟其它固有細(xì)胞有更活躍的能量代謝。因此,在病理狀態(tài)下,處于較高能量代謝水平的近端腎小管上皮細(xì)胞更容易受急性能量代謝紊亂的損害而發(fā)生凋亡,這可能是近端腎小管上皮細(xì)胞常常成為缺血、缺氧性損害或腎毒性藥物損害靶目標(biāo)的一個(gè)重要機(jī)制[6]。另一方面,由于近端腎小管高度依賴線粒體有氧能量代謝,也易于產(chǎn)生活性氧類 (ROS)從而導(dǎo)致慢性積累性氧化損傷。線粒體是細(xì)胞內(nèi)有氧能量代謝活動(dòng)的主要場(chǎng)所,在線粒體內(nèi)通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化過程產(chǎn)生ATP;但線粒體同時(shí)也是內(nèi)源性活性氧(ROS)的主要產(chǎn)生部位。因此,對(duì)能量具有高度需求的組織器官如大腦、近端腎小管等更易受到各種活性氧的慢性氧化性損害。

NaDC3是一種主要在近端腎小管上皮細(xì)胞膜表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將各種三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物從血液中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)參加三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化過程以生成ATP,因此在近端腎小管能量代謝中發(fā)揮非常重要的作用。如果NaDC3表達(dá)異常,有可能導(dǎo)致腎小管能量代謝障礙或氧化性損傷。為了探討NaDC3對(duì)能量代謝的影響,我們將NaDC3轉(zhuǎn)入腎小管細(xì)胞中過表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaDC3高表達(dá)后,短期內(nèi)可使腎小管細(xì)胞能量代謝速率增加,氧耗量和 ATP產(chǎn)生明顯增加,線粒體膜電位增加。線粒體膜電位是維持線粒體功能所必備的條件,它反應(yīng)了線粒體功能的完整性,是評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)。NaDC3高表達(dá)后使線粒體膜電位增加,這也從另一方面反映 NaDC3高表達(dá),促進(jìn)了能量代謝;但同時(shí)NaDC3高表達(dá)也使細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生量明顯增加。如果 ROS產(chǎn)生量長(zhǎng)期增加則能導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的氧化性損害,引起細(xì)胞能量代謝障礙,最終引起衰老和各種老年退行性疾病的發(fā)生。

研究已發(fā)現(xiàn)高血糖可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi) ROS過量產(chǎn)生而引起組織細(xì)胞的氧化性損傷,從而可導(dǎo)致糖尿病腎病等并發(fā)癥的發(fā)生[7];高糖也可以導(dǎo)致細(xì)胞衰老[8]。這是因?yàn)槠咸烟沁M(jìn)入細(xì)胞后可分解成乙酰輔酶A,后者與草酰乙酸結(jié)合后生成檸檬酸而進(jìn)入三羧酸循環(huán)。如果血糖過高則可通過促進(jìn)合成過多的檸檬酸而加快三羧酸循環(huán)的代謝速率,從而導(dǎo)致過量ROS的產(chǎn)生。在前期研究中我們已發(fā)現(xiàn)NaDC3長(zhǎng)期過表達(dá)可促進(jìn)二倍體細(xì)胞的衰老,但其作用機(jī)制并不清楚。結(jié)合本研究我們推測(cè)NaDC3長(zhǎng)期過表達(dá)后有可能通過促進(jìn)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)、加快三羧酸循環(huán)速率,導(dǎo)致 ROS產(chǎn)生過多從而引起了衰老,其作用機(jī)制可能與高糖類似。

[1] Pajor AM.Molecular properties of the SLC13 family of carboxylate and sulphate transporters[J].Pflugers Arch, 2006,451(5):597-605.

[2] Bai XY,Chen X,Feng Z,et al.Identification of basolateralmembrane targeting signal of human sodium-dependent dicarboxylate transporter 3[J].J Cell Physiol,2006, 206(3):821-830.

[3] 袁 莉,付 博,陳香美,等.三種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法在不同代齡復(fù)制性衰老細(xì)胞中的比較研究[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2004,20(2):257-263.

[4] Novak G.Protein kinase C-αand ERK 1/2 mediate mitochondrial dysfunction,decreases in active Na+transport,and cisplatin-induced apoptosis in renal cells[J]. J Biol Chem,2002,277(45):43377-43388.

[5] Novak G,AleoMD,Morgan JA,et al.Recovery of cellular functions following oxidant injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,1998,274(3):F509-F515.

[6] 沙繼宏,葉煦亭,吳莉麗,等.鈣及活性氧在大鼠腎缺血再灌流損傷中的作用 [J].中國(guó)病理生理雜志, 2000,16(6):531-534.

[7] Ceriello A,Motz E. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance,diabetes,and cardiovascular disease?The common soil hypothesis revisited[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(5): 816-823.

[8] 趙 力,王海昌,尹 濤,等.高糖對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的損害及胰島素的影響 [J].中國(guó)病理生理雜志, 2008,24(4):688-691.