嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作為食品級篩選標記的研究

賀松, 龔芳紅, 張德純＊, 劉明方, 程芳, 郭亞楠

(1.重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心,重慶400016;2.西安交通大學醫(yī)學院,陜西西安710061)

乳酸菌是食品安全性微生物,利用乳酸菌表達重要的醫(yī)藥功能蛋白以賦予乳酸菌新的生理功能,是開發(fā)乳酸菌應用的新領域[1]。但是目前構建的重組乳酸菌多經過了遺傳修飾,帶有抗生素抗性標記,這些抗生素抗性基因若投放到環(huán)境中或人和動物體內,由于抗性因子的轉移,會存在嚴重的生物安全隱患,因此在應用中也將受到限制。食品級載體系統(tǒng)的研究為重組乳酸菌的潛在應用提供了可能。目前國內外已有許多關于食品級篩選標記研究的報道,包括細菌素抗性及免疫性標記[2-3]、重金屬抗性標記[4]、噬菌體抗性標記[5]、營養(yǎng)缺陷互補標記[6-8]和糖類利用篩選標記[9]等。作者借鑒藍白篩選轉化子的思路,從嗜酸乳桿菌中克隆β-半乳糖苷酶(lacZ)基因,利用X-gal顯色篩選大腸桿菌和乳酸乳球菌中的陽性克隆子,并觀察以lacZ基因作為食品級篩選標記的篩選效果和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質粒 嗜酸乳桿菌(L.acidophilusATCC4356):購自中國科學院微生物所菌種保藏中心;乳酸乳球菌(L.lactisMG1363)和質粒pMG36e:由荷蘭 Groningen University J.Kok博士惠贈;大腸桿菌(E.coliDH5α):作者所在實驗室保存菌株。

1.1.2 主要試劑 M17培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基購自Oxoid公司;DNA回收試劑盒:購自Omega公司;基因組提取試劑盒,質粒抽提試劑盒,限制性核酸內切酶XbaⅠ和PstⅠ:均為 Promega公司產品;PCR及連接相關試劑:均購自 Takara公司;X-gal和ONPG:Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 含有l(wèi)acZ基因重組體的構建 根據(jù) Gen-Bank公布的嗜酸乳桿菌ATCC4356β-半乳糖苷酶(lacZ)基因序列(2 017 bp,編號:EU590652)設計一對特異性引物。

以嗜酸乳桿菌ATCC4356染色體DNA為模板,進行PCR擴增獲得lacZ基因。反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性40 s,55℃退火30 s,72℃延伸130 s,共26個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。將PCR產物切膠回收,回收產物與質粒pMG36e同步進行XbaⅠ和PstⅠ雙酶切回收處理。之后兩者在 T4 DNA連接酶作用下連接,構建的重組質粒名為pMG36e-lacZ。重組質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,轉化菌涂布于LB-Ery-X-gal平板(含200μg/mL紅霉素,臨用前2小時吸取X-gal DM F溶液50μL涂布平板)表面,37℃培養(yǎng)18～24 h,挑取藍色菌落(命名為DH5α/pMG36e-lacZ)進行傳代培養(yǎng),并對重組質粒進行 PCR、酶切和測序鑒定(由 Invitrogen公司進行)。

1.2.2 重組體電轉乳酸乳球菌MG1363

1)重組質粒的提取:大腸桿菌陽性轉化子DH5α/pMG36e-lacZ接種于 LB-Ery-X-gal平板(紅霉素終質量濃度增加為250μg/mL,其他同前),挑取藍色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(紅霉素終質量濃度為250μg/mL),37℃振蕩培養(yǎng)過夜,并用質粒抽提試劑盒提取重組質粒pMG36e-lacZ。

2)乳酸乳球菌MG1363感受態(tài)細胞制備:接種MG1363于M17肉湯培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8,在結束培養(yǎng)之前1小時加入氨芐青霉素至終質量濃度為20μg/mL。培養(yǎng)結束后將細菌培養(yǎng)物冰浴5 min,離心收集菌體,用冰冷的甘油緩沖液(100 mg/mL甘油,0.5 mmol/L蔗糖)洗滌菌體5次,然后用1∶100的甘油緩沖液重懸菌體。

3)電穿孔轉化MG1363:參見文獻[10]。電穿孔條件:電壓為2 kV,時間為5 ms。電轉化后的菌液涂布于 M17-LSCaMg-Ery-X-gal平板(含 0.5 g/dL乳糖、0.3 mol/L 蔗糖、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、5 mg/L紅霉素,臨用前2小時吸取X-gal DM F溶液50μL涂布平板),30℃培養(yǎng)48～72 h,篩選藍色菌落即為陽性重組菌,記為MG1363/pMG36e-lacZ。

1.2.3 重組菌β-半乳糖苷酶的表達 將重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-lacZ接種于10 mL LM17-Ery肉湯培養(yǎng)基(含0.5 g/dL乳糖、5 mg/L紅霉素),在30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取5 mL細菌培養(yǎng)液,離心收集菌體用500μL雙蒸水充分重懸菌體,在冰上超聲破碎菌體,然后離心收集上清液。超聲沉淀用少量水重懸后與超聲上清液、菌液一并做10 g/dL SDS-PAGE和 native-PAGE電泳分析。其中SDS-PAGE電泳后的凝膠經考馬斯亮藍R-250染色;native-PAGE電泳后的凝膠鋪在涂有100μL濃度為2 g/dL的X-gal溶液的M17平板上,30℃孵育2 h,藍色條帶顯示β-半乳糖苷酶的存在。

1.2.4lacZ基因作為篩選標記的活性及穩(wěn)定性檢測 重組乳酸乳球菌MG1363/pMG36e-lacZ分別在LM17-X-gal平板(含0.5 g/dL乳糖,臨用前2 h吸取X-gal DM F溶液50μL涂布平板)和 M17-Ery平板(5 mg/L紅霉素)上傳60代。分別將兩種平板上第1代和第60代的細菌接種于LM17肉湯(含0.5 g/dL乳糖),30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。離心濃縮菌液并用培養(yǎng)菌液重懸菌體,在冰上超聲破碎菌體,離心收集超聲上清液,采用鄰硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)法[11]測定β-半乳糖苷酶活性,結合Bradford法[12]計算β-半乳糖苷酶比活力,并對在 LM17-X-gal平板傳 60代的MG1363/pMG36e-lacZ提質粒鑒定。

2 實驗結果

2.1 重組質粒的鑒定

首先對重組質粒pMG36e-lacZ進行 PCR鑒定,1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳顯示在約2 000 bp處有一明顯條帶(圖1a)。再對重組質粒分別進行XbaⅠ、PstⅠ單酶切和雙酶切鑒定(圖1b),鑒定結果與預期目標一致。測序結果表明,pMG36e-lacZ中的lacZ基因序列與 GenBank中公布的序列符合率達97%。由此可見,重組質粒構建成功。

2.2 β-半乳糖苷酶的表達

重組菌株 DH5α/pMG36e-lacZ和 MG1363/pMG36e-lacZ在篩選平板上長出了藍色菌落,初步說明能表達有活性的β-半乳糖苷酶。SDS-PAGE分析見圖2。重組菌株在約70 000處可見一明顯的表達條帶,與天然lacZ的理論相對分子質量76 583相近。Native-PAGE分析結果見圖3。菌液、超聲上清液和超聲菌體都具有β-半乳糖苷酶活性。

圖1 重組質粒pMG36e-lacZ鑒定1Fig.1 Identification of recombinant plasmid(1)

圖2 SDS-PAG圖顯示重組菌株 MG1363/pMG36elacZ.分泌β-半乳糖苷酶Fig.2 The SDS-PAGE analysis ofβ-galactosidase secreted by recombinant strain MG 1363/pMG 36e-lacZ

圖3 重組菌株 MG1363/pMG36e-lacZ native-PAGE X-gal染色圖Fig.3 The native-PAGE figure of recombinant strain MG1363/pMG36e-lacZ stained with X-gal

2.3 lacZ基因作為篩選標記的活性及穩(wěn)定性檢測

分別對紅霉素和X-gal兩種篩選方法篩選的第2代和第61代重組菌株MG1363/pMG36e-lacZ進行酶活和比活力測定,結果見表1。結果顯示,在利用X-gal篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力與第2代相比沒有顯著差異(P=0.592>0.05);與利用紅霉素篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力相比也沒有顯著差異(P=0.882>0.05),表明lacZ基因作為篩選標記具有較好的活性和穩(wěn)定性。對X-gal篩選第60代的重組菌株提質粒進行PCR和酶切鑒定結果也表明該基因具有較好的穩(wěn)定性,見圖4。

表1 第2代和第61代重組菌株進行酶活和比活力測定Tab.1 β-galactosidase activity and specific activity of MG1363/pMG36e-lacZat t＊he 2nd generation and the 61st generation respectively

表中數(shù)據(jù)為檢測8次所得的均值±標準差。＊X-gal篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力與第2代相比,P>0.05?！鱔-gal篩選60代后的重組菌株β-半乳糖苷酶比活力與紅霉素篩選60代后的重組菌株相比,P>0.05。

圖4 重組質粒pMG36e-lacZ鑒定2Fig.4 Identification of recombinant plasmid(2)

3 結 語

β-半乳糖苷酶的主要功能是降解乳糖和合成低聚半乳糖,對生物無害,而且在生物利用碳水化合物營養(yǎng)中起著重要作用。它可以水解底物X-gal,呈現(xiàn)出藍色,易于檢測和觀察,若將此基因作為篩選標記,通過檢測藍色菌落的形成即可成功篩選出陽性克隆子[13]。最為成功的應用就以pUC系列克隆載體為基礎的藍—白篩選系統(tǒng),這一篩選系統(tǒng)利用了β-半乳糖苷酶基因的負性篩選特性。事實上,同樣可以應用β-半乳糖苷酶基因編碼產物的正性篩選方法也同樣可以獲得陽性克隆子。嗜酸乳桿菌是我們所熟悉的重要的益生菌,主要存在于酸奶等乳制品和人胃腸道中,對維持人體健康有益,甚至對一些消化道疾病有治療作用[14]。最近嗜酸乳桿菌基因組被測序(GenBank No:CP000033)[15],發(fā)現(xiàn)基因組上有一個不同于大腸桿菌乳糖操縱子的lac基因簇。特別是該基因簇除擁有一個GHF-2β-半乳糖苷酶編碼基因 lacLM外,還擁有一個GHF-42β-半乳糖苷酶基因lacZ。目前實驗所用的篩選標記主要是還有紅霉素抗性基因的,作者基于食品級載體的要求,從嗜酸乳桿菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并觀察其作為食品級篩選標記的活性和篩選穩(wěn)定性。

作者借助載體pMG36e上的 P32啟動子和嗜酸乳桿菌 ATCC4356lacZ基因的 RBS序列(TAGAGG),在乳酸乳球菌MG1363中成功表達了β-半乳糖苷酶,并通過該酶活性成功篩選出了陽性克隆子。通過對分別采用X-gal篩選和紅霉素篩選兩種方法傳60代后的酶活分析表明,以β-半乳糖苷酶(lacZ)基因作為篩選標記,能夠使載體在宿主菌中穩(wěn)定遺傳。因此,嗜酸乳桿菌ATCC4356lacZ基因可以作為一個新的食品級篩選標記應用于食品級表達系統(tǒng)。若將此食品級載體基因導入乳酸乳球菌,這種重組基因工程菌將是集菌體本身和有益基因于一體,制成活菌制劑被人利用則是安全方便的。

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