糖酯酶促合成轉(zhuǎn)化率的影響因素分析

劉巧瑜, 張曉鳴

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院,廣州510225;2.江南大學食品學院,無錫214122)

糖酯是以碳水化合物分支為親水基團,一個或多個脂肪酸作為疏水基團組成的酯類化合物。糖酯分子中同時具有親油和親水基團,是一類典型的非離子型生物表面活性劑。糖酯的 HLB值為1～16,可做水包油型(O/W)和油包水型(W/O)乳化劑[1]。目前糖酯廣泛應(yīng)用于食品[2-3]、醫(yī)藥[2]、發(fā)酵[3]、化妝品[4]、洗滌劑[5]、化肥[3]等領(lǐng)域 ,也可作為無熱量脂的代用品[6],一些糖酯及其衍生物還具有抑菌、抗病毒和抗腫瘤等活性[7-8]。近年來,全球僅蔗糖酯和葡萄糖酯的年產(chǎn)量就達到了6 000噸[9]。

化學合成是糖酯工業(yè)生產(chǎn)中目前采用的唯一方法。由于化學合成的糖酯色澤深、純度低、有一定毒性[10],目前正在研究取代糖酯化學合成的方法,其中酶促合成法最常用。根據(jù)反應(yīng)機理的不同,酶法合成糖酯的反應(yīng)主要有糖與脂肪酸的酯化反應(yīng)[11]及糖與脂肪酸酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)[12],其中轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)可分為醇解、酸解和酯交換等3種類型。影響糖酯酶促合成轉(zhuǎn)化率的因素很多,其中主要有以下6個方面。

1 糖酯酶促合成反應(yīng)器

根據(jù)操作方式不同,糖酯酶促酯化反應(yīng)器可分為間歇式反應(yīng)器和連續(xù)式反應(yīng)器。

1.1 間歇式反應(yīng)器

間歇式反應(yīng)器在反應(yīng)過程中沒有底物的補充和產(chǎn)物的導出,底物和產(chǎn)物的濃度隨反應(yīng)時間的變化而變化,僅適用于多品種、小批量、反應(yīng)速率慢的反應(yīng)過程。目前對酶催化合成糖酯的工藝研究尚處于探索階段,酶促合成糖酯時大多選用間歇式反應(yīng)器[13-15]。

1.2 連續(xù)式反應(yīng)器

連續(xù)式反應(yīng)器以一定的流量不斷補充新鮮的底物,同時以相同的流量不斷地導出反應(yīng)液,使反應(yīng)連續(xù)穩(wěn)定進行。連續(xù)反應(yīng)器可克服間歇反應(yīng)器因底物消耗或產(chǎn)物積累所導致的反應(yīng)只能在有限時間內(nèi)進行的缺點,可提高生產(chǎn)效率,是實現(xiàn)糖酯酶法合成工業(yè)化的有效途徑[16]。根據(jù)流體混合方式的不同,典型的連續(xù)反應(yīng)器可以分為連續(xù)攪拌式反應(yīng)器(ContinuousStirredTankReaction,CSTR)和連續(xù)活塞式反應(yīng)器(Continuous Plug Flow Reactor,CPFR)或填充床反應(yīng)器(Packedbed Reactor,PDR)[17]。

糖在有機溶劑中的溶解度通常較低,為維持盡量高的酯化速度,反應(yīng)器中的糖往往過量。只有溶解于溶劑中的糖才能更好地與酸和酶接觸,并參與酯化反應(yīng)。連續(xù)攪拌可促進糖的溶解,加快傳質(zhì)速度,故CSTR是在有機溶劑中酶促合成糖酯時優(yōu)先選擇的反應(yīng)器。目前,已采用CSTR連續(xù)或半連續(xù)合成了曲酸月桂酸酯[18]、麥芽糖月桂酸單酯[19]和抗壞血酸飽和脂肪酸酯[20]等糖酯。

不同的糖在有機溶劑中的溶解度差異極大,故有人采用 PDR作為糖酯酶促合成的反應(yīng)器。用PDR連續(xù)合成不同鏈長的脂肪酸抗壞血酸酯時,產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率可達 14%～17%,整個反應(yīng)可持續(xù)10d[21]。PDR還成功地合成了脂肪酸赤蘚糖酯[21]及甘露糖等己糖脂肪酸酯[22]。

2 反應(yīng)體系

底物和酶的良好接觸是酯化反應(yīng)正常進行的基本條件,因此需選擇合適的介質(zhì)將底物與酶盡量制備成均相體系。常用作糖酯酶促合成反應(yīng)的介質(zhì)體系主要有以下3種。

2.1 有機溶劑體系

有機溶劑易產(chǎn)生微水環(huán)境,抑制酶的水解活性,是酶促合成糖酯時最常用的反應(yīng)介質(zhì)。水溶性的和非水溶性的有機溶劑均可作為酶促合成糖酯的反應(yīng)介質(zhì),但對酶的性質(zhì)和酯化反應(yīng)速度有不同的影響。丙酮、乙腈和叔丁醇等水溶性溶劑有利于糖等親水性底物的溶解,但可能攫取酶分子中保持其催化活性所必需的水,降低酶的活性,甚至使其失活[23-24]。甲苯、己烷和異辛烷等非極性溶劑有助于保持酶的催化活性,但不利于糖的溶解,酯化反應(yīng)速度極緩慢[25]。有機溶劑的極性對產(chǎn)物的平衡轉(zhuǎn)化率也有一定的影響。以脂肪酶催化合成木糖油酸酯時,將溶劑由叔丁醇換成己烷后,二酯和三酯的平衡轉(zhuǎn)化率均降低,而單酯的轉(zhuǎn)化率提高[26]。

不同的酶和底物的性質(zhì)不同,因此用不同的酶催化合成糖酯時需選用不同的有機溶劑。豬胰脂肪酶在吡啶中可催化三氯乙醇脂肪酸(C2～C12)與葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖的酯化,枯草桿菌蛋白酶可在吡啶或二甲基亞砜(DMSO)中催化蔗糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖或麥芽三糖～麥芽七糖等的酯化反應(yīng)[27]。

由于糖和脂肪酸的溶解特性差異極大,單一的有機溶劑很難將兩者制備為均一的體系。將兩種有機溶劑混合,盡管有利于糖和脂肪酸的溶解,但可導致溶劑分子極性的改變,從而影響糖酯的轉(zhuǎn)化率,如木糖油酸二酯的轉(zhuǎn)化率隨著溶劑極性的下降而增大[26]。為促進酶與底物的接觸,可對底物或酶進行一定的前處理,目前常用的方法主要有:

1)糖修飾法。將糖經(jīng)過一定的修飾,增大其在溶劑介質(zhì)中的溶解度,可提高糖酯的酶促合成速度。常用的糖修飾法有縮酮式和烷基糖苷式?？s酮式修飾的糖酯化后,需在溫和的酸性條件下脫去丙酮叉,才能得到相應(yīng)的糖酯。該法可提高糖酯的產(chǎn)率,但需進行丙酮叉基團引入和脫除反應(yīng),在一定程度上增大了糖酯合成過程的復(fù)雜性[28]。引入烷基修飾基團的反應(yīng)很簡單,且一些酶促反應(yīng)的產(chǎn)物本身就是良好的表面活性劑,無需再脫去修飾基團,因此較縮酮式修飾更有應(yīng)用前景[27]。

2)硼酸-糖復(fù)合物法。糖與有機硼酸能形成可溶于多種非極性有機溶劑的硼酸-糖復(fù)合物,該復(fù)合物酯化后在極溫和條件下水解即可得到相應(yīng)的糖酯。例如,葡萄糖與苯基硼酸形成的苯基硼酸-葡萄糖復(fù)合物在叔丁醇中用脂肪酶催化,可與乙烯酯、脂肪酸或植物油發(fā)生酯化或轉(zhuǎn)酯反應(yīng),得到轉(zhuǎn)化率較高的糖酯[27]。

3)酶或糖的固定化。將酶或糖固定化可促進酶與糖的充分接觸,提高酯化反應(yīng)的速度和糖酯的轉(zhuǎn)化率。將單糖固定在硅膠上,然后用來自于南極假絲酵母菌(Candida antarctica)和皺褶假絲酵母菌(C.rugosa)的兩種脂肪酶催化合成月桂酸糖酯,均可提高糖酯的轉(zhuǎn)化率,同時均100%的在6-OH位上?；痆29]。將脂肪酶和單糖共同吸附于親水性硅膠上,還可破壞糖的晶體結(jié)構(gòu),便于糖擺脫晶格的束縛而進入酶的活性中心,增強糖與酶的接觸,從而提高糖酯的轉(zhuǎn)化率[30]。

2.2 無溶劑體系

無溶劑體系(Solvent-free System)不使用或僅使用少量的有機溶劑,可避免溶劑對酶和產(chǎn)品使用安全性的影響?！肮?固”反應(yīng)體系(Solid to Solid System)是酶促合成糖酯反應(yīng)中一種常用的無溶劑體系[27],主要由不溶的反應(yīng)物和產(chǎn)物組成。在無溶劑體系中,酶促反應(yīng)仍在液相中進行,因此液相的形成對“固-固”反應(yīng)體系至關(guān)重要[27]。反應(yīng)過程中,部分底物首先溶解于液相中,然后在酶的催化下生成產(chǎn)物。由于液相的體積很小,生成的產(chǎn)物很快從液相中析出,從而推動反應(yīng)的持續(xù)進行[31]。液相主要通過添加微量的在反應(yīng)溫度條件下呈液態(tài)的“助溶劑”形成,它的作用是將糖和酸制備成均勻的溶液體系[32]。

助溶劑通常是水、有機溶劑或水與有機溶劑的混合物。一定量的助溶劑可改善液相的組成,調(diào)節(jié)液相的體積、粘度、組成和各組分的比例及固相在液相中的分散量和分散程度,可提高反應(yīng)速度和產(chǎn)物的產(chǎn)率。在酯化反應(yīng)后期,由于產(chǎn)物的大量析出,混合物固化現(xiàn)象明顯,傳質(zhì)受到限制,酯化反應(yīng)速度降低,添加助溶劑可明顯提高反應(yīng)速度[27]。助溶劑的lgP值對酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的產(chǎn)率具有重要影響,極性較強的助溶劑可促進糖的溶解和產(chǎn)物的析出,從而有利于反應(yīng)的進行[31]。

2.3 離子液體

離子液體(Ionic Liqiuds)是由有機陽離子和無機或有機陰離子構(gòu)成的低熔點鹽類,在室溫或較低溫度(<100℃)下呈液態(tài)。離子液體是一種非水相的溶劑,具有不揮發(fā)、對熱和化學反應(yīng)穩(wěn)定及對環(huán)境友好等特性。離子液體的極性、疏水性、粘度和溶解性可通過對陽離子和陰離子的適當修飾來調(diào)節(jié)。葡萄糖和蔗糖在以1-烷基-3-甲基咪唑為陽離子的離子液體中的溶解度遠大于在叔丁醇中的[27]。與有機溶劑相比,離子液體可提高乙酸葡萄糖酯的酯化選擇性[33]。

3 水分含量

水在糖酯酶促合成反應(yīng)中具有雙刃劍的作用[34]。一方面,靠近或結(jié)合于酶活性中心的水是酶的必需水分,有利于保持酶的酯化催化活性,水也可促進糖的溶解。另一方面,水又是酯化反應(yīng)的副產(chǎn)物,水的大量生成可降低酯化反應(yīng)速度,甚至促進酯化物的水解,還可能降低酶的酯化催化活性[9,35]。

及時脫除反應(yīng)中產(chǎn)生的水可提高酯化反應(yīng)速度。常用的脫水法有吸附劑吸附脫水法[13,36-37]、共沸蒸餾法[38]、真空脫氣法[39]和蒸發(fā)法[9]。吸附劑法操作簡單,吸水劑可重復(fù)使用,是糖酯合成研究中最常用的方法[36]。硅膠和分子篩是最常用的兩種脫水劑。相對而言,分子篩具有高效的吸附性和很高的化學穩(wěn)定性,且成本低廉,容易分離和再生,故常用作糖酯酶促合成反應(yīng)中的脫水劑[13,36],但分子篩也具有一定的催化和化學吸附作用,可能促進不穩(wěn)定底物的降解以及二酯的形成等酯化反應(yīng)的副反應(yīng)的發(fā)生[36]。蒸發(fā)法可連續(xù)操作,故可用于糖酯的酶促工業(yè)化生產(chǎn)中[9]。

4 反應(yīng)溫度

提高反應(yīng)溫度可提高底物的溶解度、降低溶液的粘度,加快傳質(zhì)過程,促進底物與酶的有效接觸,加快化學反應(yīng)的速度[37]。酶的催化活性也與溫度密切相關(guān)[38]。固定其它反應(yīng)條件,僅改變反應(yīng)液的溫度,在離子液體[60%(BMIM)(BF4)+40%叔丁醇]中用Nov435脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸單酯時,40、50和 60℃時月桂酸的轉(zhuǎn)化率分別為18%、60%和11%[33]。底物對最適酯化反應(yīng)溫度也有一定的影響,如在上述體系中以 C6、C10和C12酸合成葡萄糖酸酯時,60℃時的轉(zhuǎn)化率明顯地較50℃時的高[33]。在幾乎無水的有機介質(zhì)中,酶尤其是固定化酶可維持其剛性構(gòu)象而具有更高的熱穩(wěn)定性,可耐受更高的溫度,故酶促合成糖酯時的溫度較水解反應(yīng)的高[30]。

5 底物

不同鏈長的脂肪酸中電子和原子的空間排列不同,因此可影響糖酯的轉(zhuǎn)化率[39-40]。受脂肪酸碳鏈上電子密度的影響,以非共軛酸為底物酶促合成糖酯時的最大速度與米氏常數(shù)的比值(Vmax/Km)約比共軛酸的高10倍[39];直鏈脂肪酸的約比支鏈脂肪酸的高10倍[40]。以C4～C12的脂肪酸為底物,在叔丁醇和嘧啶(9:11,v/v)組成的混合介質(zhì)中用Nov 435催化合成蔗糖酯時,初始酯化速度和糖酯的產(chǎn)率隨著脂肪酸鏈長的縮短而上升[33]。

由于只有溶解于溶劑的糖才能有效地參與酯化反應(yīng),而不同的糖在有機溶劑中的溶解度不同,因此糖也可對酯化反應(yīng)速度產(chǎn)生重要的影響。如30℃時,葡萄糖在2-甲基丁醇中的溶解度約是蔗糖的3倍[41],以2-甲基丁醇為溶劑合成棕櫚酸糖酯時,葡萄糖棕櫚酸單酯的轉(zhuǎn)化率遠高于蔗糖棕櫚酸單酯的[7]。麥芽糖在有機溶劑中的溶解性較蔗糖好,當反應(yīng)條件相同時,麥芽糖的酯化速度和轉(zhuǎn)化率均較蔗糖的高[41]。

6 酶

用于催化糖酯合成的酶主要有脂肪酶和蛋白酶等水解酶。脂肪酶可通過催化酯化反應(yīng)和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成糖酯,其中最常用的脂肪酶有來源于南極假絲酵母菌(C.antarctica)的游離脂肪酶(CALB)及固定化脂肪酶(Nov 435)[36]、來源于念珠假絲酵母菌(C.cylindracea)的脂肪酶(CCL)以及豬胰脂肪酶(PPL)[33]。蛋白酶一般通過催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成糖酯,主要有來源于桿菌屬(Bacillus)的堿性蛋白酶,它們可在極性較強的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和吡啶等有機溶劑中催化糖酯的合成[27]。α-糜蛋白酶也可在無溶劑體系中催化合成苯丙氨酸葡萄糖酯[42]。常見的催化糖酯合成的酶的種類與來源見表1[27]。

表1 常見的催化糖酯合成的酶Tab.1 Enzymes usually used in enzymatic synthesis of sugar esters

不同來源的脂肪酶在結(jié)構(gòu)上具有明顯差異,部分脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征參數(shù)見表2[43]。由于活性中心等結(jié)構(gòu)上的不同,不同脂肪酶具有不同的酯化催化活性。以Nov 435、Lipozyme IM以及來自假單胞菌(Pseudomonas)和皺褶假絲酵母菌(C.rugosa)的脂肪酶催化乳酸和辛酸合成糖酯時,僅Nov 435催化的反應(yīng)體系中有糖酯的生成[44]。

酶的酯化催化活性及選擇性與酶的來源有關(guān),還可能受到反應(yīng)介質(zhì)和底物等的影響[45]。高LogP值的溶劑有利于保持脂肪酶的酯化催化活性[40]。在含20%二甲亞砜的2-甲基丁醇中,以棕櫚酸乙酯為底物催化合成麥芽糖酯時,Nov 435催化的平衡轉(zhuǎn)化率高于固定化嗜熱真菌(T.lanuginosus)脂肪酶催化的,但后者的初始轉(zhuǎn)化率較前者高[7]。與脂肪酶相同,蛋白酶的酯化催化活性與選擇性也依賴于溶劑的性質(zhì)。在同樣的反應(yīng)條件下,堿性蛋白酶在嘧啶中表現(xiàn)出極高的酯化催化活性,而在叔丁醇和甲苯中無酯化催化活性[46]。

表2 部分脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征參數(shù)Tab.2 Structural characterisc parameters of some lipases

酶的固定化或修飾可提高酶的酯化催化活性、穩(wěn)定性和選擇性。酶的固定化有利于提高酶在有機溶劑中的分散性,促進底物與酶活性位點的充分接觸,還有利于酶的回收和再利用。由于不同的固定酶的載體具有不同的表面結(jié)構(gòu),故酶與載體的結(jié)合方式和結(jié)合位點不同,從而對固定化酶的活性和選擇性產(chǎn)生一定影響[47-48]。用表面活性劑修飾也可提高酶在有機溶劑中的催化活性和穩(wěn)定性,部分脂肪酶用葡萄糖修飾可提高其熱穩(wěn)定性[49]。

3 結(jié) 語

糖酯酶促合成中,反應(yīng)器、反應(yīng)體系、水分含量、反應(yīng)溫度、底物和酶是影響糖酯酶促合成轉(zhuǎn)化率的六大因素。糖酯酶促合成技術(shù)在食品及相關(guān)領(lǐng)域的研究目前已有很多報道,但大都還處于應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段,糖酯酶促合成的工業(yè)化嘗試還不多。隨著新型反應(yīng)器的應(yīng)用,反應(yīng)體系的建立,酶性質(zhì)的優(yōu)化和成本的降低,酶法清潔生產(chǎn)的優(yōu)越性必將促進糖酯酶促合成的突破性發(fā)展。

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