鱈魚多肽的抗氧化活性及其分離純化

牛瑞, 于建生

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,青島 266042)

鱈魚多肽的抗氧化活性及其分離純化

牛瑞, 于建生＊

(青島科技大學(xué)化工學(xué)院,青島 266042)

研究了鱈魚多肽的抗氧化活性及分離純化。為獲得高純度的抗氧化肽,將鱈魚多肽依次通過超濾、凝膠過濾層析、陰離子交換層析(Q-FF)和反相高效液相色譜層析(RP-HPLC)進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明:鱈魚多肽具有很強(qiáng)的清除羥自由基的能力、清除DPPH的能力和還原能力;經(jīng)Q-FF柱層析分離得到了B1、B2和B33個(gè)組分,B2經(jīng)RP-HPLC檢測顯示為單一峰,獲得了純度較高的鱈魚多肽,這為鱈魚多肽的開發(fā)利用提供了科學(xué)理論依據(jù)。

鱈魚多肽;抗氧化活性;分離純化

國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)經(jīng)酶解處理后會(huì)產(chǎn)生具有特殊功能的活性肽[1],其中,對(duì)多肽的抗氧化活性的研究越來越引起人們的注意?？茖W(xué)家們將目光投向了有無窮潛力的海洋資源,鱈魚(Gadous macrocephaius)就是其中一種重要的海洋資源。它屬于冷水性底層魚類,為北方沿海出產(chǎn)的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一,含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素類、鈣等營養(yǎng)元素,且價(jià)格相對(duì)較低,因此選擇鱈魚作為多肽抗氧化性研究的原料。由于酶解液中含有未水解的蛋白質(zhì)、酶及一些其他大分子物質(zhì),將其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化將有利于提高鱈魚多肽的抗氧化活性[2]。抗氧化肽以其相對(duì)分子質(zhì)量小、易吸收、活性強(qiáng)等特點(diǎn)受到重視,在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面有廣闊前景[3]。

本文采取目前常用的體外檢測物質(zhì)抗氧化活性的方法,對(duì)鱈魚多肽的抗氧化性質(zhì)進(jìn)行了研究,并且采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)手段對(duì)多肽進(jìn)行了分離,得到了具有較高抗氧化活性的多肽,為進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料與試劑

鱈魚由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所提供,鄰苯三酚、番紅花紅、DPPH、VC、茶多酚、二丁基羥基甲苯(BHT)均為進(jìn)口分裝,乙腈(色譜純)購于上海星獅生物工程有限公司,其他試劑均為國產(chǎn)商品試劑(分析純)。

1.2 儀器

20PR-52D高速冷凍離心機(jī):日本日立公司生產(chǎn);L KB 2021數(shù)控層析冷柜、瑞典L KB公司生產(chǎn); Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)美國waters公司生產(chǎn);752型紫外分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠生產(chǎn);A KTA FPLC快速液相色譜儀(FPLC):安瑪西亞公司生產(chǎn);J TM1812/30-1多功能膜小型實(shí)驗(yàn)機(jī):大連屹東膜工程設(shè)備有限公司生產(chǎn);H1650-W高速離心機(jī):長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);凝膠過濾層析柱TSK-GELG2000SW:TOSOH CORPORATION生產(chǎn);Kromasil C-18色譜柱:上海安譜科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鱈魚多肽的制備 將50 g鱈魚肉溶于150 mL蒸餾水中,攪碎,用1 mol/L的NaOH調(diào)p H至9.0,加入0.6 g海洋低溫堿性蛋白酶,40℃恒溫水浴中酶解1 h,此過程中,一直用1 mol/L的NaOH調(diào)p H,維持p H值在9.0,酶解液經(jīng)沸水浴滅酶活8 min,冷卻后10 000 r/min,離心30 min,取上清,即為鱈魚多肽。

1.3.2 樣品的抗氧化能力

1)樣品的還原能力[4]取一定濃度的樣品,加入2.5 mL p H 6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)和2.5 mL體積分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液,混勻,在50℃保溫20 min后加入2.5 mL10%的三氯乙酸,混合后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL,加蒸餾水2.5 mL和0.5 mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3,然后在700 nm波長處比色。

2)樣品的清除超氧陰離子自由基的能力 采用鄰苯三酚自氧化法[5],鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化,生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基,超氧陰離子自由基對(duì)自氧化有催化作用。具體操作:取0.05 mol/L Tris-HCl p H 8.2緩沖液4.5 mL,置25℃水浴預(yù)熱20 min,加0.1 mL不同濃度的樣品,2.5 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL,混勻后在25℃水浴中反應(yīng)4 min,立即用VC溶液終止反應(yīng),測A299nm值。以蒸餾水代替樣品做空白組,按下式計(jì)算清除率并求得IC50。

式中:A樣品、A空白分別為樣品和空白的吸光值。

3)樣品清除DPPH自由基的能力 采用DPPH·酶標(biāo)儀法[6],加不同濃度的樣品溶液100μL和1 mmo1/L的DPPH自由基甲醇溶液100μL于96孔酶標(biāo)板中,振蕩30 s,37℃保溫20 min后在517 nm波長下測定。每個(gè)樣品平行測定3次。然后按下述公式計(jì)算

自由基清除率=[1-(Ap-Ac)/Amax]× 100%.

式中:Ap為樣品和1 mmol/mL DPPH自由基反應(yīng)后的吸光值;Ac為不加DPPH自由基時(shí)樣品的吸光值;Amax為加DPPH自由基但不加樣品(以80%甲醇代替樣品)的吸光值。

4)樣品的清除羥自由基能力的測定[7]取0.025 mol/L,p H 7.4的磷酸緩沖液1mL,40μg/ mL的番紅花紅1mL,供試藥品0.5 mL,3%過氧化氫1mL(新鮮配制),0.945 mmol/L EDTA-Fe(Ⅱ) 1 mL(新鮮配制),混合后在37℃水浴中反應(yīng)30 min后在520 nm處測定吸收度?？瞻捉M以0.5 mL蒸餾水代替供試樣品,對(duì)照組以1.5 mL蒸餾水代替EDTA-Fe(Ⅱ)和供試樣品。并按下式計(jì)算清除率

式中:A樣品、A空白、A對(duì)照分別為樣品、空白和對(duì)照的吸光值。

5)樣品的蛋白質(zhì)濃度的測定 采用Folin-酚測定法[8]。

1.3.3 鱈魚多肽的分離

1)超濾分離 將鱈魚酶解液,分別選用相對(duì)分子質(zhì)量截留量為30 000、10 000、6 000的超濾膜對(duì)來自原液、30 000上、30 000～10 000、10 000～6 000和6 000下的組分測定其羥自由基清除率、蛋白濃度,計(jì)算各組分的IC50,收集活性最高的組分,凍干保存。

2)凝膠過濾層析 將超濾分離中,活性最高的組分上Superdex-peptide Gel柱,用雙蒸水平衡和洗脫,自動(dòng)分步收集器收集,用280 nm紫外光檢測,收集活性峰并冷凍干燥保存。

3)Q-FF陰離子交換層析 將上一步得到的活性部分上Q-FF陰離子交換層析柱,上樣緩沖液為5 mmol/L p H9.0,Tris-HCl緩沖液,上樣量為2 mL,洗脫時(shí)30 min達(dá)到100%B,洗脫液B=A+ 1mol NaCl,體積流量為1.0 mL/min,檢測波長為280 nm。收集活性峰并冷凍干燥保存。

4)反相高效液相色譜 進(jìn)一步經(jīng)高效液相色譜(RP-HPLC)分析,使用Kromasil C-18分析型色譜柱(5μm,4.6 mm×150mm),Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng),A液為過膜的水溶液,B液為體積分?jǐn)?shù)100%的乙腈溶液,檢測波長為280 nm,流速為1 mL/min,對(duì)洗脫得到的各峰收集濃縮,進(jìn)行抗氧化活性測定,得到單一組分。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的抗氧化能力

2.1.1 樣品的還原能力 在700 nm的波長下檢測樣品的吸光度,吸光度越大,樣品的還原能力越強(qiáng)。一般情況下,樣品的還原能力與抗氧化活性之間存在顯著的相關(guān)性,見圖1。

圖1 樣品的還原能力Fig.1 Reducing ability

由圖1可知不同抗氧化劑的還原能力的比較。鱈魚多肽的還原能力隨濃度的增加而增大,說明具有較強(qiáng)的還原能力,因此具有更強(qiáng)的抗氧化能力。相同濃度的抗氧化劑中,VC的還原能力最高,鱈魚的還原能力介于VC和BHT之間。

2.1.2 樣品的清除超氧陰離子自由基的能力 超氧陰離子是有機(jī)體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的自由基,具有很強(qiáng)的氧化能力。因此,可以通過抗氧化劑對(duì)超氧陰離子清除能力來反應(yīng)樣品的抗氧化活性。取不同濃度的抗氧化劑,測定超氧陰離子清除率,其濃度關(guān)系與自由基的清除率變化的比較如圖2。分析可知,超氧陰離子清除率均隨抗氧化劑濃度的增加而增大,多肽的清除率最低,當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí),多肽的清除率僅為38%?？赡苁怯捎谠撾牡那宄杂苫饔弥饕皇峭ㄟ^清除超氧陰離子來實(shí)現(xiàn)的。

圖2 樣品清除超氧陰離子的能力Fig.2 Scavenging ability on super oxide anions

2.1.3 樣品清除DPPH自由基的能力[9-10]DPPH·法是一種簡單快速的自由基分析方法,其原理是依據(jù)穩(wěn)定自由基DPPH·在乙醇溶液中呈深紫色,在517 nm波長處有一強(qiáng)吸收,自由基清除劑通過與其單電子配對(duì)使其顏色逐漸消失,如果有其它物質(zhì)提供一個(gè)電子使此單電子配對(duì),其吸收將會(huì)消失,褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系。因此,通過吸光度的變化可以衡量試樣清除自由基的能力,從而評(píng)價(jià)抗氧化能力。不同濃度的抗氧化劑清除DPPH自由基的結(jié)果如圖3。

圖3 樣品清除DPPH的能力Fig.3 Scavenging ability on DPPH

分析可知,抗氧化劑清除DPPH自由基的能力均隨濃度的增加而增大,相同濃度下,清除能力的大小依次為茶多酚>VC>多肽>BHT。因此,可以推斷此多肽具有較強(qiáng)的清除DPPH的能力。

2.1.4 樣品的清除羥自由基能力 羥基自由基(·OH)化學(xué)性質(zhì)非常活潑,反應(yīng)速度極快,能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生很大危害。抗氧化劑能夠清除在金屬離子的催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)生成的高活性的羥自由基,因此可以用來反應(yīng)抗氧化性的強(qiáng)弱。不同抗氧化劑清除羥自由基能力如圖4所示。每種抗氧化劑均有清除羥自由基的能力,且均隨濃度的增加而增大,當(dāng)多肽的濃度為10 mg/mL時(shí),清除率可達(dá)到83%,明顯高于VC和BHT。相同濃度下,清除能力的大小依次為茶多酚>多肽>BHT>VC。由此可知,鱈魚多肽具有很強(qiáng)的清除羥自由基的能力。

圖4 樣品的清除羥自由基的能力Fig.4 Scavenging ability on hydroxyl free radical

維生素C是公認(rèn)的羥基自由基清除劑,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)測定,鱈魚多肽的羥基自由基清除率高于相同濃度下的維生素C的清除率。同時(shí),結(jié)合清除DPPH能力,還原能力,超氧陰離子能力,得出鱈魚多肽具有較高的還原能力、DPPH清除能力,說明其具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

2.1 超濾結(jié)果與分析

鱈魚酶解液經(jīng)過30 000、10 000、6 000超濾膜,各組分活性結(jié)果如表1。

由表1對(duì)各分離組分的活性進(jìn)行比較可知,經(jīng)不同分子量的超濾截留后,各組分均有羥自由基清除活性,且活性與分子量的大小相關(guān)。各分子段截留組分的活性相差不明顯,都不超過一個(gè)數(shù)量級(jí),即活性區(qū)域集中分布不強(qiáng);各分子段截留組分的活性隨著分子量減小而增大。6 000下的活性最高,其IC50達(dá)到15.02 mg/mL。因此選擇6 000下的組分收集并凍干保存,進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

表1 超濾分離及活性測定結(jié)果Tab.1 Results of ultrafilteration and active measuring

2.2 凝膠過濾層析

經(jīng)超濾分離后,選擇活性大的6 000下的超濾凍干樣品進(jìn)行凝膠過濾層析。結(jié)果如圖5。

圖5 鱈魚多肽的凝膠過濾層析圖Fig.5 Column chromatogram of ling peptide on Superdex peptide

由圖5可知,樣品經(jīng)凝膠過濾層析洗脫后得到3個(gè)峰(A1、A2和A3),分別收集各峰并檢測其活性,發(fā)現(xiàn)3個(gè)峰均有抗氧化活性,其中A2活性最大,收集A2的樣品凍干,用于下一步分析。

2.3 Q-FF陰離子交換層析

經(jīng)凝膠過濾層析分離后,對(duì)A2的凍干樣品進(jìn)行Q-FF陰離子交換層析分離。結(jié)果如圖6。

圖6 鱈魚多肽的Q-FF陰離子交換層析圖Fig.6 Column chromatogram of ling peptide on Q-FF

由圖6可知,B1為穿透峰,B2和B3分別為梯度洗脫峰,分別收集各峰并檢測其活性,得到B2的活性最高,收集并濃縮,用于下一步分析。

2.4 反相C-18高效液相色譜

經(jīng)Q-FF陰離子交換層析后,B2濃縮的樣品進(jìn)行反相C-18的高效液相色譜分離,結(jié)果如圖7。

圖7 鱈魚多肽的RP-HPLC分析曲線Fig.7 Column chromatogram of ling peptide on RPHPLC

由圖7可知,洗脫得到兩個(gè)峰,峰1為單一組分,分別收集各峰,濃縮后檢測其活性,得到峰2無抗氧化活性,峰1有抗氧化活性。收集峰1的樣品并凍干保存,命名為LPN。

3 結(jié) 語

通過還原能力的測定、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力、清除DPPH能力來反應(yīng)其抗氧化活性,對(duì)酶解鱈魚得到的多肽進(jìn)行了抗氧化能力的研究。同時(shí),采用超濾、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、RP-HPLC對(duì)酶解液進(jìn)行了初步的分離純化。結(jié)果表明:鱈魚多肽具有較強(qiáng)的還原能力,清除羥自由基的能力和清除DPPH的能力,但清除超氧陰離子的能力較弱,從而得出鱈魚多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。同時(shí)分離純化得到了活性較強(qiáng)、純度相對(duì)較高的單一組分,命名為LPN。鱈魚多肽的抗氧化機(jī)制和分離純化還有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:楊萌)

Antioxidant Activity and Purification of Pollock Peptides

NIU Rui, YU Jian-sheng＊
(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

The antioxidant activities of Pollock peptides were studied at first in this manuscript and demonstrated he Pollock peptides had strong scavenging hydroxyl free radical activity,and scavenging 1,diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)activity,and reducing activity.In order to obtain high homogenous antipeptide,the Pollock peptides were purified by ultraffltrations,gel filtration,anion-exchange chromatography(Q-FF),and reversed phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC)in turn.These results showed that Pollock peptides separated on Q-FF column and three components(B1,B2,B3)were obtained.B2was identified by RP-HPLC to be homogenous.

pollock peptides,antioxidant activity,separation and purification

Q 517

:A

1673-1689(2010)04-0562-05

:2009-06-05

＊通信作者:于建生(1956-),男,山東青島人,副教授,主要從事生物化工方面的研究。Email:jiansheng_yu1956@163.com